一. 简介
目前制备多克隆抗体的抗原的有好几种形式：1.可溶蛋白；2.硝酸纤维素膜吸附的蛋白；3.聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上直接割胶。

如果蛋白不可溶，以包涵体的形式表达出来，而且在变性条件下纯化依然不纯，或者是目标蛋白虽然可溶，但是通过各种办法纯化都达不到纯度要求（比如说至少70%以上），那么就需要通过割胶的方式来准备抗原了。

跑SDS-PAGE电泳后割胶做抗原的方法还有一个优点，它可以增强动物的免疫反应，因为聚丙烯酰胺可以起到抗原缓释的作用，使得抗原在动物体内停留更长的时间，从某种角度来说，聚丙烯酰胺也起到了佐剂的作用。

另外，如果蛋白不易得到，也可以用这种方法来制备抗原免疫动物。比如，我们也经常用5-10ug的总蛋白来免疫小鼠，也取得了不错的效果。由于聚丙烯酰胺的免疫原性很高，因此某些情况下，对于制备的多克隆抗体，需要做抗原亲和纯化。

二. 材料
1. 凝胶电泳装置；酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳或者SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
2. 染色液：50%甲醇/10%乙酸，0.1%考马斯亮蓝R
3. 脱色液：50%甲醇/7%乙酸
4. 2%戊二醛
5. 切胶仪
6. 洁净锋利的刀片
7. 塑料离心管和乙醇
8. 冻干机、干冰
9. 一次性注射器（3毫升和1毫升）
10. 18-gage针
11. 铲和称量纸
12. 弗氏完全弗氏不完全佐剂
13. 磷酸盐缓冲液（PBS）
14. 乳化针头，18-g
15. 7-8周龄的雌性小鼠或者新西兰大白兔

三. 实验方法
1.电泳结束后，凝胶染色30min，脱色30-45min。结束后，将凝胶浸泡在2%的戊二醛溶液中45-60min，目的是为了让凝胶中的蛋白发生交联。该步骤可以让蛋白在随后的脱色过程中尽量的减少损失，同时也将蛋白交联形成多聚体，从而增强免疫反应。交联结束后，脱色过夜。
2.在切胶仪中，将目的条带切下，装入锥形的离心管（EP管）中，冻在干冰中，并冻干。
3.冻干样品的粉碎（这一步很困难），加入弗氏佐剂，在注射器中研磨(简单的说就是在两个对接的注射器中互相推拉)。
4.免疫动物

四.注意事项
1. 通过这种方法制备的抗体既可以识别变性的蛋白，也可以和天然蛋白发生反应。
2. 由于戊二醛有毒，因此必须除净，可通过多次更换脱色液的方式来除掉戊二醛。可通过鼻子闻一闻来判断戊二醛有没有除净。但丙烯酰胺有毒，但是聚丙烯酰胺几乎无毒，对一只小鼠来说，单次注射50平方毫米的聚丙烯酰胺凝胶是极限了。
3. 弗氏完全佐剂用于首次免疫，随后的免疫一般用不完全弗氏佐剂。
(by admin)

2014-09-25