质粒编号
质粒名称
规格
价格
V014721
pFREE
5 μg (冻干粉)
我们所展示的质粒图谱主要是从文献和开放数据库中收集而来，主要是为了方便研究工作，其中一小部分质粒进行了质量控制，可供科学家使用。
所有的产品都严格仅供科学研究使用，不能应用于临床试验，包括人体摄入、注射或外用的药理学用途。
确保质粒的关键元件正确，但是我们并不能保证实验结果。页面展示的图谱序列为理论序列，可能与测序结果不一致，请自行比对后确定是否满足要求。(如果测过序，本页面一般会提供下载)
开放数据库中的大多数载体序列都没有被完全测序。如果实际序列与参考序列的相似度超过99%，则将其视为正确。
由于科学研究是在探索未知，具有很大的不确定性，在任何情况下，我们都不承担超出质粒本身的额外经济损失或责任。
- 载体名称:
- pFREE
- 载体抗性:
- Kanamycin
- 载体长度:
- 7682 bp
- 载体类型:
- Genome editing
- 复制子:
- ColA ori
- 宿主:
- E. coli
- 启动子:
- rhaB
- 感受态:
- Stbl3
- 培养温度:
- 37℃
pFREE 载体图谱
质粒操作方法
1. 发货形式：质粒干粉(常温运输，存于-20度，请务必先转化提质粒后使用)
2. 收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O溶解质粒;（质粒复测的浓度有时候与标称值差距较大，这可能是因为冻干质粒在管中的位置、复溶效率、测量偏差以及管壁的吸附导致，因此建议先转化提质粒后再使用）
3. 取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
4. 加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min (30℃培养1-1.5小时);
5. 6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
6. 将平板倒置37℃培养14h，如果要求是30℃则培养20h; (菌落过多则将质粒稀释后再转化；没有菌落则加入10μl质粒转化；建议不要直接转表达感受态， 要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态);
7. 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
pFREE 载体序列
LOCUS 62056_10960 7682 bp DNA circular SYN 01-JAN-1980
DEFINITION synthetic circular DNA.
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS .
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 7682)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..7682
/mol_type="other DNA"
/organism="synthetic DNA construct"
protein_bind 1..19
/label=tet operator
/note="bacterial operator O2 for the tetR and tetA genes"
CDS 130..4233
/codon_start=1
/label=Cas9
/note="Cas9 (Csn1) endonuclease from the Streptococcus
pyogenes Type II CRISPR/Cas system"
/translation="MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKK
NLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEES
FLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK
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QQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLL
RKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARG
NSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEY
FTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFD
SVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEER
LKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFM
QLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGR
HKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLY
LYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVP
SEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH
VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYL
NAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKT
EITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSK
ESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGI
TIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNE
LALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILAD
ANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVL
DATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD"
terminator 4285..4332
/label=T7 terminator
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
CDS 4466..5086
/codon_start=1
/label=TetR
/note="tetracycline repressor TetR"
/translation="MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHV
KNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTR
PTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTT
DSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS"
CDS complement(5254..6066)
/codon_start=1
/label=KanR
/note="aminoglycoside phosphotransferase"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
promoter complement(6067..6158)
/label=AmpR promoter
rep_origin complement(6176..6811)
/direction=LEFT
/label=ColA ori
/note="Plasmids containing the ColA origin of replication
can be propagated in E. coli cells that contain additional
plasmids with compatible origins."
protein_bind complement(6975..6996)
/label=CAP binding site
/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
misc_RNA complement(7060..7138)
/label=tracrRNA
/note="trans-activating CRISPR RNA for the Streptococcus
pyogenes CRISPR/Cas9 system"
promoter 7193..7309
/label=rhaB promoter
/note="promoter of the E. coli rhaBAD operon, conferring
tight induction with L-rhamnose and repression with
D-glucose in the presence of RhaR and RhaS (Giacalone et
al., 2006)"
repeat_region 7310..7345
/label=DR
/note="direct repeat for the Streptococcus pyogenes
CRISPR/Cas system"