WRKY是植物中最大的一类转录因子家族，该家族蛋白质中都含有WRKY结构域，这种结构域由60个氨基酸残基组成，其N端有保守的WRKYGQK 序列，WRKY由此得名，WRKY结构域的C端是锌指结构。根据蛋白质中WRKY结构域的数目和锌指结构特征，WRKY家族被分为三类。WRKY家族成员 广泛地参与植物的各个生理过程，如OsWRKY13参与了抗病、氧还平衡(Redoxhomeostasis)、生物胁迫响应和生长发育等过程，超量表达 OsWRKY13影响了这些途径中500多个基因的转录。OsWRKY23的表达部位主要在根和衰老叶片中，而OsWRKY51和OsWRKY-71的主 要表达部位是在胚和糊粉层细胞中，超表达OsWRKY89的转基因植株会对水稻早期生长造成影响。
除在水稻正常生长中发挥作用外，也有多篇WRKY转录因子与抗病相关的报道。在拟南芥中异源表达水稻的OsWRKY6可以加强OsPR1启动子驱动 的报告基因的表达，在植物防卫基因的转录过程中起正调控作用。超表达OsWRKY12(原文编号为OsWRKY03)会导致OsPR1b和NB8等防御相 关基因的表达量下降，表明其对水稻抗病是一个负调控因子;OsWRKY22缺失的水稻突变体对稻瘟病菌感病，而超表达OsWRKY22可增强稻瘟病抗 性;OsWRKY45缺失会使苯并噻二唑(BTH)诱导的水稻稻瘟病抗性明显下降，超表达则可显著提高叶片对白叶枯病和穗颈瘟的抗性;OsWRKY53可 特异性地结合在W盒序列元件上，调控病程相关基因如PR10(PBZ1)、PR5、PR14、过氧化物酶和几丁质酶等的表达，超表达OsWRKY53可以 提高水稻对稻瘟病的抗性。超表达OsWRKY55(原文编号为OsWRKY31)的水稻提高了对稻瘟病的抗性，并使防卫相关基因(如PBZ1和 OsSci2)和早期生长素应答基因(如Os-IAA4和OsCrl1)组成型表达。另外，超表达植株对高浓度吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的敏感度降低，提示Os-WRKY55可能是水稻生长素应答和防卫应答信号转导途径的共享成员;超表达 OsWRKY62抑制了4个PR相关基因(Betv1、PR1a、PR10和PBZ1)的转录，并提高了对病原物侵染的敏感性;Os-WRKY84(原文 编号为OsWRKY33)可被OsB-WMK1磷酸化，进而与W盒元件结合，将Os-WRKY84和OsBWMK1的共表达可增强W盒元件和PR1基因的 表达;JA和紫外线-B强烈诱导OsWRKY89的转录，超表达OsWRKY89可以增强水稻对白叶枯病菌、白背飞虱的抗性以及对紫外线-B的耐受能力。 从现有报道不难看出，通过遗传手段改变WRKY的表达对水稻抗性有较大的影响，说明WRKY与抗病途径存在着密切的关联。
Xa21是最早克隆的水稻白叶枯病广谱抗性基因，编码受体激酶。通过酵母双杂交鉴定了多个Xa21抗病途径元件，包括编码ATPase的XB24、 泛素连接酶XB3、XB15(蛋白磷酸酶2C)和XB10(WRKY62)。来自白叶枯病菌的Ax21可以被XA21蛋白质识别，从而启动抗病反应。在抗 病过程中，XA21的激酶区会转位至细胞核中并与WRKY转录因子结合。本实验室也鉴定了多个在Xa21介导的抗病过程中表达发生变化的PR蛋白质、 WRKY转录因子等，为进一步的功能鉴定提供了基础数据。
在前期工作中，采用水稻全基因组基因芯片鉴定到400多个在抗病过程中转录发生变化的基因，其中涉及多个WRKY成员。另外，根据RiceNet的 预测，Xa21介导的抗病途径可能涉及的基因有800多个。以往对WRKY的研究主要靠遗传手段改变WRKY的表达，但在大多数情况下，对自然状态下 WRKY在水稻体内的表达变化情况知之甚少。为了获得WRKY在水稻正常生长和Xa21介导的抗病过程中的表达数据，本研究分析了8个WRKY家族成员， 包括5个用芯片鉴定的差异转录基因和3个相关文献报道的WRKY。通过制备这些WRKY特异的抗体，利用免疫印迹 (westernblotting，WB)技术检测了它们在正常生长和抗病过程中的表达丰度变化，为探索WRKY成员的功能，了解水稻抗病机理提供了蛋白 质水平的实验数据。
1 材料与方法
1.1 水稻材料
叶片材料取自水稻品种9311苗期地上部(株高分别为1cm、2cm、5cm、10cm和15cm)以及大田生长的分蘖期、孕穗期、开花期和成熟期 的叶片;4021是将Xa21基因转入TP309而获得的纯合转基因株系，对白叶枯病菌PXO99野生型呈现抗病反应(R)，对白叶枯病菌突变株 PXO99-ΔraxST表现感病反应(S)。
1.2 接种
白叶枯病菌菌株PXO99由中国科学院遗传发育所朱立煌研究员提供，ΔraxST质粒DNA由美国加州大学戴维斯分校Ronald教授提供，将该质 粒转化PXO99菌株后获得了PXO99ΔraxST菌株，该菌株表现为avr缺失的表型。白叶枯病菌在PSA培养基中(0.5%细菌蛋白胨，2%蔗 糖，0.05%L-谷氨酸)30℃培养48～72h后，用水稀释至109个CFU/mL，用灭菌剪刀蘸取菌液剪切叶片进行接种，以灭菌蒸馏水作为对照 (Mock)。水稻接种一般在6周左右进行，接种后分别于0h、2h、8h、24h、48h、72h、120h、168h和240h在距剪切部位 1～2cm处采集叶片材料，液氮速冻后于－70℃保存。
1.3 多克隆抗体制备
目标蛋白质序列来自水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu)。利用BEPITOPE软件预测抗原决 定簇，选择峰值较高的片段，面向水稻全蛋白质组进行设计后用BLASTP软件对水稻蛋白质库(http://rice.plant- biology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml)进行唯一性检测，确定目标多肽片段。以合成多肽作为免疫原，多克隆抗体的制备由北京华大蛋白质研发中心有限公司完成。
1.4 Dot-blot
双蒸水溶解多肽，用10 μL 点样枪将溶解的多肽点在NC膜(1cm×9cm)上，点样体积为2μL，同时点BSA作为对照。37℃干燥后，用5%BSA的TBS- T(20mmol/LTris-HCl、150mmol/LNaCl、0.05%Tween20、pH7.5)室温封闭1h，然后分别将NC膜与WRKY 抗体(1∶1000稀释)孵育30min，用TBS-T溶液漂洗3次(3×5min)，用辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔二抗孵育30min，用 TBS-T溶液漂洗3次(3×5min)，再用TBS洗1次(5min)，加入ECL显色试剂，用保鲜膜包好后在暗室中用?骞馄?检测。
1.5 水稻蛋白质提取
将－70℃冻存的水稻叶片在液氮中充分研磨成细粉状，加入蛋白质提取液，混匀冰上放置10min，然后12000rpm4℃离心20min，取上清即为总蛋白质，具体方法参考文献。
1.6 WB分析和信号采集
WB分析方法参考文献，试验至少重复3次，并使用HSP蛋白质进行检测，作为等量加样的内参。用ImageJ软件扫描χ光片上的WB条带信号，计算3次WB信号的平均值及偏差，比较其信号的相对强度。
1.7 WRKY编码基因的转录分析
从水稻MPSS(Massively parallel signature sequencing)网站(http://mpss.udel.edu/rice/)下载数据，统计目标基因的转录信息，按每千万条MPSS标签的基因 转录次数进行不同样品间转录信号强度的相对比较。
2 结果与分析
2.1目标基因的选择
本研究选取了8个WRKY家族成员作为靶基因，其中OsWRKY40/64、43、50、52和86选自用水稻全基因组基因芯片鉴定的白叶枯病抗性 过程中的差异转录基因，OsWRKY12、OsWRKY55和Os-WRKY84则为文献报道与水稻抗病相关。表1 列出了所选目标基因的信息，包括功能注释、蛋白质分子量、所属类别和抗原决定簇的多肽序列等。
2.2 抗体制备与特异性鉴定
为了保证抗体的特异性，用BEPITOPE软件预测靶蛋白质的抗原决定簇，具体序列见表1。为了检验这些多肽在水稻全基因组序列中的唯一性，又采用 BLASTP软件对水稻蛋白质库(http://rice.plantbiology.msu.edu /analyses_search_blast.shtml)进行分析，结果表明，表1中多肽序列均是靶蛋白质特异的(数据未显示)。为了进一步鉴定抗体 的特异性，将多肽点在NC膜上，用WRKY抗体进行Dot-blot检测，由图1可见，所制备的抗体仅特异识别相应的多肽，与其他多肽间没有交叉反应。
2.3 WRKY蛋白质在水稻叶片生长过程中的表达
取水稻苗期叶片(1cm、2cm、5cm、10cm和15cm)和分蘖期、孕穗期、开花期与成熟期展开叶片，提取总蛋白质，用WRKY蛋白质特异抗 体进行WB检测(图2)。从图2可见，OsWRKY12、43、55和86表现为苗期表达量较低，但随叶片的生长蛋白质表达量也逐步增加，一般在成株期表 达量达到最高;OsWRKY50和84在苗期表达量相对较高，成熟期下降。在叶片生长各时期均未检测到Os-WRKY40/64和52蛋白质的表达(数据 未附)。上述结果表明，OsWRKY12、43、55和86可能在水稻叶片正常生长方面发挥着作用，OsWRKY50和84可能主要在苗期发挥作用。
2.4 水稻与白叶枯病菌的互作
在水稻分蘖期接种白叶枯病菌15d后，比较病斑长度并拍照(图3)。带有Xa21的4021接种PXO99野生型后呈典型的抗病反应，病斑长度小于 1.0cm，4021接种PXO99ΔraxST后呈现感病反应，病斑长度均超过10cm，Mock(4021-H2O)反应没有形成明显的病斑。
2.5WRKY蛋白质在水稻抗白叶枯病反应中的表达
为了解WRKY蛋白质在Xa21介导的水稻抗白叶枯病菌过程中的表达情况，用WB检测了在抗病反应不同时间点WRKY蛋白质的表达丰度(图4)。结 果显示OsWRKY40/64、50在接种后5d、OsWRKY52在接种后1d有明显的诱导条带出现，其表达量随接种时间延长呈现明显的增加。 OsWRKY84在接菌前期有一定的本底表达，从第5d开始可检测到表达量的明显上升。OsWRKY40/64和50的诱导条带出现在45kD处，比预测 分子量(36kD)略大，但在叶片中未检测到这2个蛋白质的表达，所以OsWRKY40/64和50的表达是受白叶枯病菌诱导的。OsWRKY52的诱导 条带出现在75kD左右，约为预测分子量(37kD)的2倍，推测接菌后OsWRKY52的表达量上升，且以二聚体的形式出现。OsWRKY12、43、 55和86在接种后不同时间点没有检测到可见的变化。
2.6 WRKY蛋白质在不同水稻-Xoo互作反应中的表达
为了解WRKY蛋白质在水稻与白叶枯病菌互作过程中的表达情况，对4个在抗性反应中发生丰度变化的WRKY蛋白质做了进一步分析，比较了它们在抗病 (R:4021-PXO99)、感病(S:4021-PXO99ΔraxST)和对照(M:4021-H2O)反应3个时间点(0、72和120h)的表 达量变化(图5)。从图5可以看出，与对照相比水稻接种Xoo后Os-WRKY40/64、50、52和84蛋白质在抗、感反应中均发生了明显可见且相似 的表达变化，提示在抗感反应间有相对保守的分子特征。具体比较抗、感反应中WRKY蛋白质的表达变化幅度可以看出(图5-B)，OsWRKY50、52和 84在抗病反应中的表达量均高于感病反应中的表达量，说明这3个WRKY蛋白质的表达变化具有抗病反应的特异性。有意思的是，WRKY40/64在抗病反 应中的表达量低于在感病反应中的表达量，该蛋白质的表达具有一定的感病依赖性。
2.7WRKY基因转录与蛋白质表达的关联分析
为了对WRKY的基因转录和蛋白质表达信号进行关联分析，根据采集的MPSS数据统计了WRKY基因的转录信息，连同上述蛋白质表达信息进行汇总 (表2)。由表2可见，与WB检测的蛋白质表达信息相比，MPSS检测提供的转录信号较低，在叶片生长和抗病过程都分别有4个WRKY没有MPSS信号。 在抗病反应中，OsWRKY50和84的蛋白质表达和RNA转录的变化趋势比较符合，都呈现受诱导表达提高的特征，除此之外没有发现二者间明显的关联性。 这一比较说明，WRKY基因的转录和蛋白质翻译间的关联性较低，独立地了解二者的变化对其功能的了解都是有帮助的。
3 讨论
在水稻基因组中有120多个WRKY家族成员，是最大的转录因子家族之一。现有证据表明，WRKY在多种生命活动中都发挥着重要作用，通过转基因提 高或降低WRKY基因的表达，可以对水稻的抗病性产生影响。了解水稻体内WRKY在正常生长和抗病过程中的表达模式，本研究选择了8个WRKY成员，制备 了其抗体，并通过WB技术调查了在水稻叶片生长过程和Xa21介导的白叶枯病抗性过程中的表达，发现这些WRKY成员有不同的表达模式。众所周知，蛋白质 是生命活动的直接执行者，对蛋白质表达特征的了解可以为功能研究提供有价值的线索。
在水稻叶片正常生长过程中没有检测到Os-WRKY40/64和52的表达信号，基本排除了它们在叶片生长中发挥功能的可能性。OsWRKY12、 43、55和86在苗期表达量较低，随生长逐渐升高，而OsWRKY50和84在前期表达信号较高，而后期有所下降。在Xa21介导的白叶枯病抗性过程 中，OsWRKY40/64、50、52和84受诱导表达，其余的WRKY表达量没有变化。综合这些数据可以推测，OsWRKY40/64和52可能只在 抗病过程中发挥作用，而OsWRKY12、43、55和86主要是在叶片正常生长过程中有功能。有意思的是，Os-WRKY50和84既受白叶枯病菌的诱 导又在水稻苗期表达，说明它们在2种生长过程中都发挥作用。本研究涉及的8个WRKY分别属于不同的类别，OsWRKY84和86属于Ⅰ类WRKY家族成 员，OsWRKY12和43属Ⅱ类，OsWRKY40/64、50、52和55属Ⅲ类(表1)，未发现蛋白质表达特征与所属类别的相关性。遗传分析表明， 超表达Os-WRKY12对水稻抗病性有负面的影响，而超表达OsWRKY55可提高水稻对稻瘟病菌的抗性，但
本试验没有检测到二者在白叶枯病抗性过程中的蛋白质丰度变化，说明人为改变WRKY表达所产生的抗性和抗病基因介导的抗性其机理并不完全一致。值得 指出的是，超表达OsWRKY84可增强水稻的抗性，在Xa21介导的抗病过程中也发现了OsWRKY84的诱导表达，二个来源的数据比较符合。
本研究观察到OsWRKY50在叶片和抗病过程中的表观分子量明显不同，为了验证这一现象，将2种水稻材料同时进行WB分析也获得了相同的结果(数 据未附)。推测发生这种现象的原因:一是源自基因选择性拼接造成的，OsWRKY50蛋白质的不同表达形式，对此检索了水稻的基因组数据库，未见到其他的 表达版本;二是源自蛋白质的不同修饰形式或二聚化，虽然二者的分子量均较理论分子量有较大的增加，但也不太符合修饰或二聚化现象;三是源自抗体的非特异性 识别，尽管通过Dot-blot实验和生物信息分析提供了一些抗体特异性的证据，但仍不能排除这种可能性。若进一步究其原因，可结合转基因试验展开后续研 究。
比较WRKY蛋白质的WB表达结果和基于MPSS的转录数据，发现在抗病反应中Os-WRKY50和84的蛋白质表达和RNA转录间的变化趋势比较 符合，除此之外，大部分数据之间的关联并不明显。本研究有5个候选WRKY来自用芯片鉴定的抗病过程中的差异转录基因(表1)，其中有3个 WRKY(OsWRKY40/64、50和52)在抗病过程中呈现蛋白质表达受诱导(图4)，其符合率略高，但二者间也不是完全对应。据报道，基因转录和 蛋白质合成之间变化的不一致是普遍现象，这一现象提示人们在关注基因转录的基础上，要加强对蛋白质的表达特征的了解。显然，蛋白质表达信息能够为功能研究 提供更为直接的数据。在本试验中，用WB检测到一些高于靶蛋白质理论分子量的条带，可能是蛋白质修饰或多聚化的结果，当然也不能完全排除非特异杂交的可 能。
通过制备目标蛋白质特异的抗体，可以了解特定蛋白质的表达，这种策略被称为基于抗体的水稻蛋白质组学策略(Antibody- basedRiceProteomics，AbRP)。这种策略可以直观地鉴定特定蛋白质的表达变化，相对基于质谱的蛋白质组学策略而言，该策略具有更高 的灵敏度、特异性并易于操作。
利用这一策略，鉴定了多个PR基因及其他抗病相关基因的表达。本试验中所制备的抗体大都具有良好的检测效果，能够特异性地识别目的条带，这些抗体还 可能用于WRKY蛋白质的相关研究，如检测它们在其他生物或非生物逆境胁迫的表达，进行蛋白质的组织或亚细胞定位以及调查与其他蛋白质的相互作用等。(来源：期刊)
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271107.html
(by admin)
2014-10-27