口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)有7个血清型和80多个亚型,且极易发生突变. C型FMD在印度、菲律宾和哈萨克斯坦等我国周边国家曾有流行,是重点防控疫病. 单抗与多抗血清相比,更为高效、准确且特异性强,目前已被广泛用于传染病的研究诊断和治疗中.口蹄疫防控的关键是对口蹄疫、流行血清型的快速鉴定和免疫接 种,而获得型特异性抗体是口蹄疫病毒定型和加强其疫苗研究的前提.本试验制备抗C型FM-DV的特异性单抗,旨在为C型口蹄疫的诊断及预防提供特异、敏感 的试剂,为进一步研究奠定基础.
1 材料和抗体制备方法
1.1 病毒、细胞和试验动物
C型FMDVVP1蛋白由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室提供.C型、A型、Asial型、O型口蹄疫病毒、猪水疱病病毒 (SVDV)及Sp2/0骨髓瘤细胞、BHK-21幼仓鼠肾传代细胞均由兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室提供. BALB/c雌性小鼠,6~8周龄,体质量18~20g,购自兰州生物制品研究所.
1.2 主要试剂
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜(DMSO)、HT粉剂、氨基喋呤(A)粉剂、抗体亚型鉴别试剂盒、PEG1500均购自美国Sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司.
1.3 抗原制备
将C型FMDV接种于BHK-21单层细胞,37℃吸附1h,加入含2%小牛血清的DMEM继续培养,待70%的细胞发生病变时收获病 毒,3500r/min离心30min.将细胞病毒悬液用环化的2-溴乙胺氢溴酸(BEI)10mmol/L灭活病毒(37℃,24h),再加入2%的硫 代硫酸钠中和BEI.8000r/min离心40min,收集上清.按PEG80μg/mL、NaCl40μg/mL加入离心收集的上清液中,搅拌4h 后,于8000r/min离心40min,收集上清.超声波裂解后用紫外分光光度计测定蛋白含量.分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后对动物进行免 疫.
1.4 动物免疫
取纯化的抗原按100μg/只,加等体积弗氏完全佐剂于背部皮下多点免疫4~5周龄BALB/c雌性小鼠.2周后用弗氏不完全佐剂二免.再2周后以 不加佐剂的等量抗原进行三免,再1周后尾静脉采血测定抗体效价,取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉注射加强免疫1次,第3d进行细胞融合.
1.5 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选 取BALB/c雌性小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞,免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞,按5∶1~10∶1的比例在PEG1500作用下融合.以含 10% HAT的1640培养液于37℃、5%CO2的条件下培养.4~5d后用间接ELISA方法测定细胞培养上清效价,包被抗原为C型FMDV VP1蛋白.对初步筛选的阳性孔细胞进行有限稀释,并亚克隆至所有的单克隆细胞孔检测为阳性.
1.6 抗体亚型测定 用抗体亚型鉴别试剂盒,根据使用说明书,采用间接ELISA方法检测阳性单克隆细胞的培养上清.
1.7 单克隆抗体的大量制备 对BALB/c雌性小鼠腹腔注射液体石蜡,将筛选得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养,7~10d后将杂交瘤细胞离心收集并计数,按1×106~5×106个 /只注射到用液体石蜡处理过的小鼠腹腔中.约6~7d后可见腹部明显膨大,10~14d后,小鼠临近死亡前收集其腹水.
1.8 单抗的纯化 采用辛酸-硫酸铵法,腹水用滤纸过滤,滤液用4倍体积60mmo1/L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后,用NaOH调pH至4.5.逐滴加入辛酸(终浓度 25μL/mL),室温搅拌30min后,以6000~8000r/min离心30min,收集上清液.过滤2次,将滤液与10×PBS(0.lmol /L,pH7.4)按10∶1比例混合,pH调至7.4,置冰浴冷至40℃.每毫升上述混合液加0.277g固体硫酸铵,40℃搅拌30min,以 4000~6000r/min离心20min,将沉淀溶于少量PBS,透析,测蛋白含量,-20℃冻存.用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,SDS- PAGE电泳鉴定蛋白纯度.
1.9 单抗特性分析
1.9.1单抗的特异性检测 用间接ELISA方法,将C型、A型、Asia1型、O型FMDV标准抗原、重组表达的C型FMDVVP1蛋白、3ABC重组蛋白及猪水疱病病毒 (SVDV)适当稀释后分别包被酶标板,一抗为阳性杂交瘤细胞株的培养上清,二抗为HRP标记山羊抗鼠IgG,用TMB底物显色,测定D450nm值.
1.9.2单抗稳定性和敏感性测定 将单抗扩大培养并连续传代,同时制备腹水.间隔一定时间复苏冻存的杂交瘤细胞,用间接ELISA对其不同代次的细胞培养上清及腹水上清效价进行检测.
1.9.3 Westen-blot鉴定 对纯化后的C型FM-DV单抗进行SDS-PAGE电泳,之后转印到硝酸纤微素膜上,5%脱脂乳粉封闭过夜,纯化的单克隆抗体(McAb)按1∶1000 稀释后作为一抗,山羊抗鼠IgG-HRP按1∶5000稀释后作为二抗,室温作用2h,最后用二氨基联苯氨(DAB)显色液避光显色10~15min,观 察特异蛋白条带.
1.9.4 单抗中和效价测定参照文献固定病毒-稀释腹水McAb的方法.倍比稀释小鼠腹水,并与等体积的C型FMDV混合,于37℃孵育1h.每个稀释度的病毒和抗 体混合物加在96孔板中,同时设阴/阳性血清、全病毒、稀释液及正常细胞对照.再向每孔中加入约5×104个BHK-21细胞.接毒48h后,作最终判 定,3次重复.该McAb腹水的50%中和效价为能够保护50%培养细胞不发生病变的McAb腹水的最高稀释度.实际每孔病毒量应包含 100TCID50.
2 结果与分析
2.1重组蛋白鉴定 在细胞融合前对C型FMDVVP1蛋白进行SDS-PAGE检测.C型FMDVVP1蛋白为33ku.SDS-PAGE结果显示,在大约33ku处仍可见清晰条带(图1).
2.2免疫小鼠抗体效价检测 用间接ELISA测得三免后1周小鼠抗血清效价均高于1∶25600.选取其中效价最高的1只进行细胞融合.
2.3 阳性杂交瘤细胞株筛选 细胞融合后,于半量换液期间用间接ELISA方法检测,抗原用C型FMDV的VP1蛋白.经过多次有限稀释和亚克隆,获得2株稳定分泌抗C型FM-DV的VP1蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为3B3和6D5.
2.4 单抗亚型测定及杂交瘤细胞染色体鉴定 采用亚型鉴定试剂盒得出3B3为IgG1,6D5为IgG3.染色体计数结果显示,杂交瘤细胞染色体数在98~106条之间,符合Sp2/0与脾细胞染色体数
之和.
2.5单抗腹水的纯化 用辛酸-硫酸铵法纯化收集的腹水上清,并用BCA蛋白定量试剂盒测得蛋白浓度:3B3为1346μg/mL,6D5为1619μg/mL.用C型FMDV重组蛋白VP1作为间接ELISA的包被抗原,获得了单抗细胞培养上清、腹水及纯化蛋白效价.
2.6单抗特异性检测 通过间接ELISA,得知获得的2株单抗均只与C型FMDV及其重组表达的VP1蛋白反应,而与A型、Asia1型、O型FMDV、重组表达的3ABC蛋白及猪水疱病病毒(SVDV)均不发生反应.
2.7单抗稳定性和敏感性测定 对获得的2株杂交瘤细胞进行连续传代试验,用间接ELISA测得25代内其腹水效价并无太大差异。
2.8 SDS-PAGE及Westen-blot鉴定 纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳,结果显示2株单抗以IgG 重链和轻链为主,分子量分别为45.0ku和25.0ku左右,与预期结果一致.用纯化的C型FMDV VP1蛋白进行Westen-blot鉴定,2株单抗在大约33ku处与C型FMDV VP1蛋白均呈现特异性反应条带.
2.9单抗中和效价测定 在中和试验中,所有阴/阳性血清、全病毒、稀释液及正常细胞对照均成立.该试验结果表明,2株单抗均能抑制病毒感染BHK-21细胞,3B3和6D5单抗腹水的50%中和效价分别为1∶1280和1∶640.
3 讨论
本试验纯化了灭活的C型FMDV,并用其作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞进行融合,筛选出2株能够稳定分泌抗体的单抗. VP1蛋白含FMDV主要的抗原表位141~160位及200~213位氨基酸残基,这两部分可与抗体特异结合,是决定FMDV抗原性的主要组分.由于C 型FMDV的VP1蛋白保存时间较长,故在细胞融合前先对该蛋白进行SDS-PAGE检测,结果表明该蛋白保存较好.Lundberg等在研究中发现用表 达蛋白免疫小鼠可以避免散毒的危险.本试验在免疫小鼠时也曾用C型FMDV 的VP1蛋白作为抗原,但免疫小鼠的抗血清效价较低.用灭活的全病毒免疫小鼠,可使其体内产生结构蛋白和非结构蛋白的抗体.故本研究采用纯化的C型 FMDV 结构蛋白VP1作为ELISA 方法的包被抗原进行筛选.融合前免疫小鼠抗体效价高达1∶25 600,为制备单抗奠定了基础.细胞融合时选用PEG 1 500,虽然其融合效果不如PEG 4000,但是对细胞的损害程度比较小,故
细胞总体融合率并不低.有限稀释法既能获得单个稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,又能防止在筛选中丢失阳性杂交瘤细胞.由于个体差异,不同代次小鼠腹水效价之 间会偶尔出现相差一个稀释度的现象.抽取腹水离心后,其下层沉淀为阳性杂交瘤细胞,可将其无菌收集,重新注射到用液体石蜡处理过的空白小鼠体内,能够获得 效价更高的腹水.ELISA 和Westen-blot结果显示,获得的3B3和6D5 2株单抗,可与C型FMDV及其重组蛋白VP1高特异性结合,且与其他血清型的病毒、重组表达的3ABC蛋白及猪水疱病病毒(SVDV)无交叉反应,表明 这2株单抗具有较高的型特异性.此外,制备的2株单抗对C型FMDV 具有良好的中和活性,其中和效价不低于1∶1 280和1∶640.此高特异性的单抗可用于对C型FMDV的抗原表位分析及特异性诊断. （来源：期刊）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271109.html
(by admin)
2014-10-27