Class I新城疫病毒NP重组蛋白的表达及广谱性NDV单克隆抗体的制备

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性、烈性、高度接触传染性禽传染病,严重危害世界养禽业的健康发展。NDV是副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的唯一成员,其基因组为不分节段的单股负链线性RNA。按照3'- Leader-NP-P-M-F-HN-L-Trailer-5'的顺序,NDV依次编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白 (F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)共6种结构蛋白。NDV只有1个血清型,根据其基因组结构和遗传距离可分为Class I(15198nt)和Class II(15192或15186nt)2个分支。自1926年新城疫首次暴发以来,造成4次世界性大流行的强毒株以及现阶段使用的弱毒疫苗株都属于 Class II分支。而Class I分支在2006年才被首次报道存在,现有的自然分离株均为弱毒株。Class I毒株具有宿主高度迁徙性的特点,极易在野鸟、水禽和家禽中相互传播,进而逐渐进化成为临床致病的强毒。早期的研究证实,从野生水禽分离到的不具致病性的 NDV弱毒株经过SPF鸡体内9次气囊传代和5次脑内传代后,可突变为NDV强毒株,对鸡可以造成100%的致病和致死。

Class I毒株的NP蛋白全基因长度为1747bp,与全基因组长度为15186nt的Class II毒株的长度一致,但相较于全基因组长度为15192 nt的Class II毒株,其非编码区1647nt后缺失了6个核苷酸。NP蛋白阅读框为1470bp,编码489个氨基酸,分子质量约为53ku。NP蛋白是病毒粒子中 含量最丰富的蛋白,不同毒株的NP蛋白保守性较高。NP蛋白在病毒RNA复制过程中起到关键的作用,只有被NP蛋白包裹后病毒基因组才能作为转录和复制的 模板,同时也逃避了宿主RNA酶的降解。此外,NP蛋白还具有天然的免疫原性,常用于监测疫苗接种程序和临床诊断。因为NP蛋白的保守性高、免疫原性好, 而一般认为Class I毒株是目前所有NDV毒株的起源。因此,本研究选用在原核表达系统中表达Class I新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株的NP蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过抗体制备技术获得具有高度广谱的针对新城疫病毒NP蛋白的单克隆抗体,为新城疫快速诊断方法的建立提供理论依据和生物学工具。

1 材料与方法

1.1 病毒、实验动物及细胞系

鸭源Class INDV Duck/JS/10分离株以及Class I强毒株9a5b均由本实验室保存。其他基因型NDV毒株来源及详细描述见表1。小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0由本实验室保存,鸡成纤维细胞系DF1由扬州 大学秦爱建教授惠赠,均用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养。SPF级BALB/c小鼠由斯莱克实验动物中心提供。SPF鸡胚购自北京梅里亚 维通实验动物有限公司。

1.2载体和主要试剂

pET-32a-c(+)原核表达载体购自Novagen公司。高保真酶(AccquireTaqPolymeraseHF)购自In- vitrogen公司。凝胶回收试剂盒和BL21(DE3)感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司。EcoR I和Xho I限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。DMEM培养基、澳洲源胎牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗 鼠IgG、荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。ECL发光试剂盒、预染蛋白质Marker均购自Thermo公司。DAPI染 色液以及显影定影试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

1.3 Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的克隆与原核表达

根据已发表的Duck/JS/10弱毒株NP基因序列设计并合成引物,上游引物NP-F:5'- GAGAATTCATGTCCTCTGTATTCGATGAA-3',下游引物NP-R: 5'-TCTCTCGAGCTAGTATCCCCAGTCGGTGT-3'。以Duck/JS/10弱毒株全基因组克隆质粒为模板,扩增NP基因,并定向 克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体中。经测序鉴定后,将阳性克隆转化BL21(DE3)感受态细胞,用1mmol/LIPTG进行诱导表达,并 对重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。最后,采用Ni-NTA亲和树脂对目的蛋白进行纯化。

1.4动物免疫及间接ELISA的建立

将纯化得到的NP重组蛋白与等量弗氏完全佐剂完全乳化,皮下注射4~6周龄BALB/c小鼠,每只小鼠接种100μgNP重组蛋白。此后,每间隔2 周,取NP重组蛋白与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后进行腹腔注射免疫,剂量减半,2次加强免疫后采取小鼠血清进行抗体效价检测,并选择效价较高的小鼠腹腔 注射50μg不含佐剂的重组蛋白加强免疫,3d后取小鼠脾细胞进行融合,并采集血清作为后续单克隆筛选的阳性对照。

1.5 单克隆抗体的制备

对上述加强免疫后的小鼠在第72小时按刘秀梵叙述的方法进行细胞融合及间接ELISA筛选。筛选时采取纯化的pET-32a-c(+)-NP重组蛋 白以及pET-32a-c(+)载体自身带His标签的融合蛋白分别包被酶标板,并以SP2/0细胞培养上清作为阴性对照,当D450nm值大于阴性对照 D450nm值的2倍时判定为阳性。以此标准,选取与pET-32a-c(+)-NP重组蛋白反应阳性、而不与pET-32a-c(+)载体自身带His 标签的融合蛋白反应的细胞培养孔进行亚克隆。采用有限稀释法进行亚克隆3~5次,直至所有杂交瘤培养上清均为阳性,最终选取反应性最强的单克隆扩大培养作 为建株细胞。采取常规方法制备腹水,并测定抗体效价。

1.6 间接ELISA检测

采用间接ELISA测定腹水的抗体效价,用纯化后的重组蛋白包被酶标板,并将腹水做梯度稀释,同时设置阳性对照与阴性对照。抗体效价定义为当D450nm值大于或等于阴性对照D450nm值2倍时的最高血清稀释度。

1.7 间接免疫荧光试验

将细胞飞片置于60mm细胞培养皿中并接种DF1细胞,待其生长至70%时感染5MOI的Duck/JS/10病毒,同时设立未感染孔作为阴性对 照。感染后第12小时用40mL/L中性甲醛固定细胞,以制备的腹水作为一抗,FITC标记的山羊抗鼠IgG作为二抗,最后将细胞飞片置于载玻片上,在荧 光显微镜下观察结果。

1.8 Western-blot检测

在60mm细胞培养皿中接种DF1细胞,待其生长至70%时感染5MOI的Duck/JS/10病毒,同时设立未感染孔作为阴性对照。在感染后第 12小时用细胞裂解液常规制备蛋白样品,加入5×蛋白上样缓冲液,煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。一抗为适当 比例稀释后的各株腹水,二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG,用ECL增强显色试剂盒进行压片显影。

1.9 NP单克隆抗体与不同毒株反应性的检测

采用Western-blot分别检测NP单克隆抗体与不同NDV毒株(9a5b,Herts/33,F48E8,LaSota,ZJ1)之间的交 叉反应性。在60mm细胞培养皿中接种DF1细胞,待其生长至70%时分别感染5MOI的不同NDV毒株,同时设立未感染孔作为阴性对照。在感染后第12 小时用细胞裂解液常规制备蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳,将制备的单抗腹水按比例稀释后作为一抗进行Western-blot检测。

2 结果

2.1 NP基因的扩增及重组表达载体的构建

NDV Duck/JS/10株的NP基因大小为1467bp,经琼脂糖凝胶电泳分析扩增得到了与预期大小一致的特异性条带。将该基因回收并经 EcoRI+XhoI双酶切后定向克隆至pET-32a-c(+)载体中。经酶切鉴定及测序分析表明,NP基因的开放阅读框已经被正确插入到原核表达载体 pET-32a-c(+)中,且方向正确,重组表达载体pET-32a-c(+)-NP构建成功。

2.2pET-32a-c(+)-NP重组蛋白的诱导表达及表达产物的纯化

重组表达载体pET-32a-c(+)-NP转化BL21(DE3)感受态细胞,用1mmol/LIPTG进行诱导表达。表达产物经SDS- PAGE分析显示,在约71ku处出现与预期融合蛋白大小一致的条带,说明NP重组蛋白成功在上清中表达。将上清蛋白经过Ni-NTA柱纯化,获得纯化的 NP重组蛋白。

2.3阳性杂交瘤细胞株的建立及腹水抗体效价的测定

用纯化后的NP重组蛋白免疫小鼠,经过融合、筛选及亚克隆,最终获得2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别将其命名为1H3和3F5。将这2 株杂交瘤细胞分别接种小鼠腹腔制备腹水。经ELISA测定,这2株单抗腹水的效价分别为1∶3.5×107和1∶6.8×105。

2.4NP单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA)试验

将2株单抗腹水与接种Duck/JS/10毒株的DF1细胞进行间接免疫荧光检测,结果显示,分别以这2株特异性针对重组蛋白NP的单抗腹水为一 抗,可在细胞质中检测到特异性的点状黄绿色荧光,IFA效价可达1∶103。而未接种NDV的细胞中检测不到特异性的荧光,这一结果证实了反应的特异性。

2.5NP单克隆抗体的Western-blot检测

分别用2株单抗腹水检测Duck/JS/10株感染的DF1细胞样品,Western-blot结果表明,1H3和3F5这2株单抗腹水均可识别 NDV的NP蛋白并出现特异性的条带,条带大小与预期相符(53ku),并且不与未接种NDV的DF1细胞样品反应。Western-blot特异性检 测。结果显示,无论是Class I毒株还是两种不同基因组长度的Class II毒株,2株NP单克隆抗体均能与其反应并出现特异性条带(。这说明本试验制备的NP单克隆抗体具有良好的通用性,这可能与不同新城疫毒株的NP蛋白的 同源性较高有关。

2.6NP单克隆抗体与不同NDV毒株反应性的检测

将制备的2株单克隆抗体与本实验室保存的NDV其他Class I和Class II的代表性毒株进行

3讨论

新城疫是一种可以导致多种禽类感染死亡的烈性传染病,对养禽业构成了巨大的威胁,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的疾病之一。自1926 年新城疫首次暴发以来,一共发生了4次世界范围的大流行,造成了严重的经济损失。因此,提高对Class I NDV的监测力度将有利于对新城疫大流行的暴发提供预警预报。此外,近年来由于NDV的毒力不断演变,感染范围也越来越广,所以做出快速而准确的诊断就成 了有效控制疫情发生的关键。目前对于新城疫的临床诊断技术最常用的是血凝(HA)试验和RT-PCR检测。但在实际应用中上述两种方法均存在较大的弊 端:HA试验灵敏度低且容易受外界条件影响而产生误差。NDV各个基因型之间差异较大,RT-PCR检测无法涵盖所有的流行毒株。而单克隆抗体技术的出现 与应用为NDV的快速检测提供了理论基础。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好、结果易分析、操作简便、可标准化等特点,目前已有针对NDV结构蛋白的单克 隆抗体并用于快速诊断的报道。但是国内研制的NDV单克隆抗体多为针对HN或F蛋白的,由于这两种蛋白在不同NDV毒株之间变异较大,所以,它们不便应用 于临床对NDV的鉴别诊断。而NDV病毒粒子中含量最为丰富的NP蛋白,在不同毒株之间同源性较高且具有良好的免疫原性,制备出针对新城疫病毒NP蛋白的 单克隆抗体将为NDV的临床检测提供快速高效的工具。本研究通过构建pET-32a-c(+)-NP重组表达载体,原核表达NP重组蛋白并免疫小鼠,经过 3次亚克隆后,成功制备得到2株针对NP蛋白的单克隆抗体。经过试验验证,这2株单克隆抗体均具有ELISA、IFA和Western-blot效价,具 有较高的临床应用价值。此外,笔者还对这2株单克隆抗体进行了NDV代表毒株的交叉反应性试验。据报道,一般常用间接ELISA法进行单克隆抗体特异性的 检测。由于ELISA对包被抗原的纯度和浓度要求较高,所以阳性判定标准也较难界定,结果往往不具有较高的准确性。因此,本试验采用了操作复杂但结果更为 直观且精准的Western-blot进行单克隆抗体特异性的鉴定。结果显示,无论是Class I毒株还是两种不同基因组长度的Class II毒株,2株NP单克隆抗体均能与其发生特异性反应,这说明该单克隆抗体的识别位点可能位于NP蛋白的保守区域。此外,本试验所选取的毒株既有分离株也 有标准毒株,既有弱毒疫苗株也有国内外经典强毒株,自然宿主既有家禽也有水禽。因此,本试验制备的单克隆抗体具有巨大的临床应用价值。如果能结合基因型特 异性抗体联合使用,将对NDV的快速检测产生重要的影响。

本研究获得了2株针对Class I新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,并具有良好的特异性与通用性,该单克隆抗体的成功研制将为进一步研究NP蛋白功能以及与其 他病毒蛋白或宿主细胞的相互作用提供研究工具,并为实现新城疫的临床快速诊断提供理论基础。(来源:期刊)
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271113.html

(by admin)

2014-10-27