人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种双链DNA病毒,约有200余种亚型。根据病毒的基因组结构、生物学特性和致病性,可分为五大类,即α、β、γ、μ和ν,6型 和11型HPV是低危型,属于α乳头瘤病毒,超过90%的生殖器疣是由此类HPV引发的。11型HPV主要感染鳞状上皮,导致上皮增生,引起各种皮肤疣和 黏膜乳头瘤。HPV11E7基因全长297bp,编码的HPV11E7蛋白含98个氨基酸,相对分子质量(Mr)约为10800。HPV11E7蛋白定位 于细胞核,其C端具有含2个Cys-X-X-Cys基序的锌指结构,其入核主要通过Ran依赖性途径。近C端的富含亮氨酸的区域76- IRQLQDLLL-85,则通过CRM1依赖的方式介导HPV11E7蛋白的出核。HPV11E7蛋白可使p130失稳,第39、42位的非保守赖氨酸 致其生物学功能衰减。6型和11型HPV可结合NuMA,并引起有丝分裂缺陷,这与16型HPVE7蛋白的功能十分类似。HPV11E7蛋白有较强的免疫 原性,是目前研究治疗性疫苗主要的靶位点之一。但是目前尚无商业化的HPV11E7蛋白或抗体。通过分子克隆和原核表达的方法获得HPV11E7蛋白可为 进一步研究HPV11E7蛋白的功能、开发治疗性疫苗提供实验基础。而HPV11E7蛋白多克隆抗体的成功制备,则可为临床和科研提供有效的检测手段。
本研究采用相对成熟的原核表达体系,利用GST融合表达系统,提高靶蛋白的可溶性,并优化了蛋白诱导条件和免疫方案。经证实,该实验体系可获得大量纯化HPV11E7蛋白及其特异性多克隆抗
设计引物用于构建pEGFP-C1-HPV11E7真核表达载体(表1),以HPV 11 purified plasmid DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物连接至pMD18-T Vector,经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后回收DNA并连接至pEGFP-C1载体,经酶切鉴定和测序后,扩增质粒,准备转染HEK293T细胞。
表1用于HPV11E7真核及原核表达载体构建的引物
HPV-11E7(pGEX-4T2) F:GAATTCCCCATGGAAGACTTGTTACC
(pGEX-4T2) R:CCGCTCGAGCGGTTCATGGTTTTGGTGCGCAGATGG
HPV-11E7(pEGFP-C1) F:GAATTCTATGCATGGAAGACTTGTTACCC
(pEGFP-C1) R:GGATCCTTATGGTTTTGGTGCGCAGATG
HPV-11E7 F:ATGCATGGAAGACTTGTTACCC
For identification R:TTATGGTTTTGGTGCGCAGATG
GAPDH F:GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA
GAPDH R:TTCACACCCATGACGAACAT
1材料和方法
1.1 材料 （省略）
1.2方法
1.2.1 HPV11E7原核及真核表达载体的构建 设计引物用于构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体(表1),以HPV全病毒基因组质粒(HPV11purifiedplasmidDNA) 为模板,用PCR进行扩增,将PCR产物连接至pMD?K18-TVector,将经EcoRⅠ和NotⅠ酶切后回收的DNA片段连接至pGEX-4T2载 体,经酶切鉴定及测序后,转化至E.coli JM109待用。IPTG至终浓度为0.2mmol/L,并在26℃诱导6h,离心收集细菌,经超声破碎裂解,离心分离上清和沉淀。经150g/L SDS-PAGE鉴定细菌裂解产物的上清中含目的蛋白GST-HPV11E7(Mr37000)后,取菌液上清与谷胱甘肽亲和层析柱结合、凝血酶切除 GST标签,PBS透析过夜。经凝胶电泳鉴定蛋白纯度,并定量。
1.2.2 细胞转染将处于对数生长期的HEK293T细胞,取2.5×105个细胞接种于3.5cm培养皿和预置细胞爬片的6孔板中培养(完全培养基:含 100mL/LFBS的DMEM、37℃、50mL/L CO2). 转染前6h将完全培养基础培养基DMEM,按照LipofectamineTM2000说明书操作,将重组质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1- HPV11E7各取4μg分别和8μL的Lipofectamine TM2000在无血清培养基中混匀30min,滴加至预备的培养皿及6孔板中,6h后换成完全培养基。继续培养24h后荧光显微镜检测转染效率。
1.2.3 反转录PCR鉴定HPV11E7基因的mRNA表达 HEK293T、转染pEGFP-C1质粒的HEK293T细胞、转染pEGFP-C1-HPV11E7质粒的HEK293T细胞分别用TRIzol提取 RNA,经过紫外分光光度测定浓度及纯度。分别取1μg,经反转录后,取5μL反转录产物作为模板,分别进行PCR,引物见(表1)。PCR产物经 10g/L琼脂糖凝胶电泳,由紫外凝胶成像仪拍照。
1.2.4 重组GST-HPV11E7蛋白的表达、纯化及鉴定 将测序正确的重组载体pGEX-4T2-HPV11E7转化大肠杆菌JM109感受态细胞。接种于含有100μg/mL氨苄青霉素 (ampicilin,Amp)的LB培养液中,37℃培养。待A600达0.6时,加入IPTG 至终浓度为0.2 mmol/L，并在26℃诱导6 h，离心收集细菌，经超声破碎裂解，离心分离上清和沉淀。经150 g /L SDS-PAGE 鉴定细菌裂解产物的上清中含目的蛋白GST-HPV11E7( Mr 37 000) 后，取菌液上清与谷胱甘肽亲和层析柱结合、凝血酶切除GST 标签，PBS 透析过夜。经凝胶电泳鉴定蛋白纯度，并定量。
1.2.5 HPV11E7蛋白兔多克隆抗体的制备和 纯化纯化 透析所得的HPV11E7蛋白经定量后,免疫新西兰雌兔。免疫分5次,即初次免疫,3次加强免疫和终免疫。初次免疫:HPV11E7蛋白500μg,稀释 至1mLPBS中,与等量的完全Freund佐剂乳化,于兔子背部多点皮下注射。加强免疫:每隔10d以500μgHPV11E7蛋白稀释至1mL与等量 的不完全Freund佐剂乳化,共3次。7d后兔耳缘静脉采血5mL并离心获得血清,通过双向免疫扩散测定血清效价(大于1∶5008符合要求)。终免 疫:500μg的HPV11E7蛋白直接于兔腹股沟区皮下注射。5d后心脏取血,分离得血清于-20℃保存。按蛋白G琼脂糖说明书,血清经亲和层析获得兔 抗HPV11E7多克隆抗体IgG。
1.2.6 Westernblot分析HPV11型E7蛋白多克隆抗体IgG效价 HPV11E7蛋白经SDS-PAGE后转膜,以不同滴度的多克隆抗体为一抗,HRP标记的山羊抗兔二抗进行免疫印迹反应,ECL显色。牛血清白蛋白 (bovineserumalbumin,BSA)作为空白对照。取培养皿中转染pEGFP-C1、pEGFP-C1-HPV11E7的HEK293T细 胞提取蛋白,经150g/L SDS-PAGE后转膜,以1∶1000稀释的兔抗HPV11E7多克隆抗体IgG为一抗、1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG孵育后,ECL 显色。未转染的HEK293T细胞作为对照,GAPDH蛋白作为内参照。
1.2.7免疫荧光鉴定HPV11型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性 上述HEK293T细胞爬片(未转染、pEGFP-C1及pEGFP-C1-HPV11E7转染)用40g/L多聚甲醛固定10min,1mL /LTritonX-100孵育8min,均在室温下进行。PBS洗3遍后用100mL/L山羊血清封闭2h,1∶500抗HPV11E7兔多克隆抗体 IgG为一抗,4℃孵育过夜,PBS洗3遍后,经荧光抗体AlexaFlour?K555标记的山羊抗兔二抗(1∶500)避光孵育1h后,PBS洗3 遍,0.5mg/LDAPI避光染色5min,PBS洗3遍。荧光显微镜观察。
2结果
2.1 重组HPV11E7原核表达载体的构建与鉴定 原核表达载体构建过程中,在HPV11E7基因的两端,引入了EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,将基因克隆至pMD-18T载体及亚克隆至pGEX-4T2 载体时,分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,结果各切出1条约310bp的条带(图1),并对克隆成功的pGEX-4T2-HPV11E7进行测 序,经BLAST比对,完全正确。
2.2重组HPV11E7真核表达载体的构建与鉴定
真核表达载体构建过程中,在HPV11E7基因的两端,引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,将基因克隆至pMD-18T载体及亚克隆至 pEGFP-C1载体时,分别用BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定,结果各切出1条约310bp的条带(图2),并对克隆成功的pEGFP-C1- HPV11E7进行测序,经BLAST比对,完全正确。
2.3 RT-PCR检测HPV11E7在HEK293T细胞中的表达 HEK293T细胞经pEGFP-C1和pEGFP-C1-HPV11E7质粒转染24h后,用TRIzol提取RNA,取1μg,经RT- PCR,20g/L琼脂糖凝胶电泳显示,HEK293T细胞经pEGFP-C1-HPV11E7质粒转染后,HPV11E7 mRNA显著表达(图3)。
2.4 GST-HPV11E7融合蛋白的获得及鉴定 原核表达载体pGEX-4T2-HPV11E7转化的大肠杆菌JM109,经0.2mmol/L浓度的IPTG、26℃诱导培养约6h,收集菌液,用 PBS重悬后超声粉碎,离心后取上清。150g/LSDS-PAGE分析,在Mr37000处出现目的蛋白条带,符合预期Mr(图4)。上清再经谷胱甘肽 亲和层析柱吸附、吸附柱经PBS清洗7~10次,再由凝血酶酶切GST标签,并最终获得HPV11E7蛋白,待透析纯化后放置-80℃备用,取少量蛋白经 150g/LSDS-PAGE分析,在Mr11000处出现目蛋白条带,符合HPV11E7蛋白预期Mr(图5)。
2.5 抗HPV11E7多价兔抗血清的效价鉴定 利用双向免疫扩散试验,检测免疫兔所得血清的效价,结果显示最大效价比达1∶32。未免疫接种的兔血清与蛋白行双向免疫扩散,结果与PBS均呈阴性。说明免疫后的兔血清含有较高效价的多克隆抗体。
2.6 抗HPV11E7多克隆抗体IgG的Westernblot效价 测定将HPV11E7蛋白电泳后,用该多克隆抗体进行Westernblot效价鉴定,在Mr11000处出现特异蛋白条带,BSA对照呈阴性。说明制备 所得的多克隆抗体,能特异性识别HPV11E7蛋白,且抗体效价超过1∶64000(图6)。用制备所得的多克隆抗体同时检测pEGFP-C1- HPV11E7转染后的HEK293T细胞裂解产物,在Mr39000处出现EGFP-HPV11E7融合蛋白的特征条带。而转染pEGFP-C1或未转 染的HEK293T细胞则未见相应条带(图7)。
2.7 免疫荧光分析HPV11E7抗体特异性用免疫荧光法鉴定 抗HPV11E7多克隆抗体IgG是否能识别HEK293T细胞表达的HPV11E7蛋白,发现在未经转染的HEK293T细胞中无绿色或红色荧光。而转 染pEGFP-C1及pEGFP-C1-HPV11E7的细胞中可见绿色荧光蛋白的表达。经重组质粒pEGFP-C1-HPV11E7转染的 HEK293T细胞可见红色荧光表达,而转染pEGFP-C1质粒的细胞中未见红色荧光。说明抗HPV11E7兔多克隆抗体IgG可有效识别 HEK293T细胞表达中的E7蛋白(图8)。
3讨论
原核表达是最常用的蛋白表达方法之一,其优点在于能够在较短时间内获得蛋白,而且所需的成本相对低廉。但与此同时原核表达系统也存在许多难以克服的 缺点:如无法对蛋白表达水平进行调控;有些蛋白的持续表达可能会产生毒性作用,过量表达可能导致非生理反应;目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物不可溶 并影响后续纯化;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低等。
本研究采用GST融合表达,可显著提高HPV11E7蛋白的可溶性。并在此基础上通过缩短诱导时间,降低诱导温度,并进一步调整IPTG的浓度,在该体系中尽量避免了包涵体的出现,为蛋白的后续纯化及动物免疫创造了有利条件。
11型HPV是引起皮肤和肛门外生殖器黏膜良性疣状增生性病变的主要HPV亚型之一。目前市面上已有预防性HPV疫苗,但是预防性疫苗对已存在的 HPV感染及其相关疾病并无明显疗效。因此,研制HPV治疗性疫苗至关重要。HPV11E7蛋白具有较强的免疫原性,是当前研究治疗性疫苗及高效特异性抗 HPV药物的主要靶位点之一。然而目前HPV体外培养和感染模型很难建立,一定程度上限制了对HPV感染的研究。国内尚无商业化的HPV11E7蛋白及抗 体,到目前为止,HPV的临床检测手段仍然较单一。
本研究通过自行构建的原核表达载体pGEX-4T2-HPV11E7诱导高表达的可溶性GST-HPV11E7融合蛋白,经酶切纯化所得的 HPV11E7蛋白具有较高的纯度和免疫原性,可进一步用于开展低危型E7蛋白功能学及局部感染细胞免疫机制等研究。获取的HPV11E7蛋白采用多次间 隔免疫,获得的血清经IgG纯化,通过Westernblot效价分析及免疫荧光鉴定具有较好的敏感性和特异性。
HPV11E7蛋白的获得及其多克隆抗体的成功制备为深入研究该蛋白的生物学功能,并为研发治疗性疫苗奠定了基础。此外,还可在目前的实验基础上开展相关临床应用,并展开以E7蛋白为靶位点的疫苗研发。（来源：期刊）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271114.html
(by admin)
2014-10-27