P53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of P53，AS-PP)家族是新近发现的与P53有关的肿瘤抑制基因家族。研究此蛋白如何促进肿瘤细胞凋亡已成为当今热点话题。现己发现了该基因家族的3个 成员:ASPP1、ASPP2和iASPP。对ASPP的调控机制需要进一步探讨。通过抑制iASPP或激活ASPP来提高P53诱导细胞凋亡的功能。本 研究根据生物信息学软件分析人ASPP1蛋白的二级结构、亲水性、疏水性和抗原性等理化性质，经同源性检索，综合考虑抗体设计的其他因素，设计一段多肽，制备多克隆抗体。同时采用免疫组织化学方法(SP法)检测ASPP1在结肠癌组织及正常组织中的表达情况，分析其在分化程度、浸润深度、淋巴结转移及预后的关系。为结肠癌的预后评估及指导综合治疗等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 ASPP1抗原与实验动物 ASPP1抗原由本实验室提供，新西兰大白兔购自吉林省生物制品所。
1.1.2 资料选择 选取北华大学附属医院2005年1月至2010年12月住院手术治疗的结肠癌病人30例。其中男性16例，女性14例;平均年龄57.5岁(40～75岁)。正常结肠黏膜15例，标本来自北华大学附属医院病理科保存的蜡块。
1.1.3 试剂盒 S-P免疫组织化学染色试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。Western印迹试剂盒，购自北京西美杰生物技术有限公司。
1.1.4 主要试剂 完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购自北京鼎国生物公司;人ASPP1蛋白和HRP标记羊抗兔IgG抗体购自SantaCruz公司;ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。
1.2 研究方法
1.2.1 生物信息学分析登录进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov，采用Blastn和Blastx程序，进行同源性检索和保守性分析。采 用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT蛋白数据库和DNAstar(Protean)生物信息学软件对ASPP1的二级结构、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基酸的带电性等理化性质进 行分析。
1.2.2 ASPP1多肽的设计与合成根据生物信息学分析和预测，按抗原性、亲疏水性和同源性分析，设计并合成一段多肽，即ASPP1:NH2-HIVKFLLDFGVNVNAADSDG-COOH。多肽的合成和与载体蛋白-血蓝素联接交由纽普生物完成。多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成多肽片段，利用高效液相法进行纯化，纯化后的样品再用HPLC分析，纯度为95%。
1.2.3 动物免疫 纯化后的多肽抗原液250μl与等体积的CFA混合，充分乳化后采用背部多点注射法免疫新西兰白兔。2w后取多肽抗原液加等体积IFA同法加强免疫，以后 每2w免疫1次，全程免疫5次。末次免疫后5～7d耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清达理想效价后颈动脉放血，收集兔血清。
1.2.4 免疫兔血清采集及纯化 采用颈总动脉放血法收集兔血清。盐析法初步纯化兔血清。
1.2.5 间接ELISA方法测定血清效价 于注射免疫程序开始前和每次注射免疫后1w，从兔耳缘静脉取血1ml，离心取上清测定血清效价。经过包被，洗涤，封闭，洗涤，加一抗，洗涤，加二抗，洗 涤，显色，终止反应等过程。酶标仪测定A492值，以(被检标本值－空白值)/(阴性对照值－空白值)即P/N≥2.1为阳性。
1.2.6 多克隆抗体的Western印迹鉴定 蛋白SDS-PAGE转膜，以纯化的免疫兔血清为一抗，羊抗兔HRP-IgG抗体为二抗，以免疫前兔血清为阴性对照，通过ECL显色系统进行Western印迹检测。
1.2.7 免疫组织化学染色方法 取组织切片，其中结肠癌组织30例，正常结肠组织15例，应用过氧化物酶标记的链霉素染色进行免疫组织化学染色(SP法)。
1.2.7.1 免疫组织化学染色步骤切片脱蜡，水化，水浴法抗原修复，3% H2O2阻断内源性氧化物酶活性。正常血清孵育，滴加ASPP1抗体，4℃过夜，依次经PBS洗涤，孵育，DAB染色后，苏木精复染，脱水，透明，封片。
1.2.7.2 检查结果判断 用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照。染色结果判定以肿瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，高倍镜下取4个视野个计数200个细 胞，按阳性细胞所占百分比将染色结果分为:阳性细胞＜5%为(－);阳性细胞5%～25%为(+);阳性细胞25%～50%为(++);阳性细胞＞50% 为(+++)。
1.3统计学分析应用SPSS17.0软件进行分析，采用计数资料四格表及四格表的确切概率法相关分析等方法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 多肽抗体的制备和 效价 以合成的多肽为抗原包被酶标板，鉴定制备的兔抗血清是否具有识别多肽抗原的免疫反应性。结果显示ASPP1肽段具有良好的免疫原性，在接受第1次免疫后 2w即第3周，体内抗体滴度开始上升，5次主动免疫结束后即第9周，兔抗血清与多肽抗原发生强阳性反应;对照组兔血清不与多肽发生免疫反应。家兔免疫后获 得的血清进行倍比稀释，随着血清稀释度的增加，其反应孔OD值降低，以P/N≥2.1为阳性，间接ELISA测定效价均＞1∶160000，表明获得高效 价的多抗。
2.2 多肽抗体的特异性 为了检测兔血清的特异性，笔者将ASPP1蛋白经SDS-PAGE转印至PVDF膜上，以免疫兔血清进行Western印迹分析。结果显示转印至PVDF 膜上的ASPP1、蛋白与免疫兔血清分别在约120kD、124kD和91kD处形成单一阳性染色带，与其蛋白分子量的理论值相符;兔阴性对照血清无条带 出现;表明获得了抗ASPP1的多克隆抗体。2.3免疫组化结果ASPP1主要在癌细胞胞浆中表达，为胞浆内出现粗细不一的棕黄色颗粒，在一小部分结肠癌 的细胞核中也有弱阳性表达。ASPP1在分化程度上的表达有显著差异性(P＜0.05)。ASPP1在癌组织的高、中、低分化程度上的表达表现为分化程度 越低，其表达越弱。在浸润深度及有无淋巴结转移中的表达无显著性差异(P＞0.05)。ASPP1在结肠癌与正常结肠组织中比较无显著性差异 (P＞0.05)
3讨论
结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发生是多种因素相互作用的结果，其中结肠腺瘤是结肠癌发生的重要病因之一。结肠癌的腺瘤-癌序列学说中，细胞增殖与凋亡失衡是结肠癌发生的重要机制。
凋亡是一种细胞受环境刺激后，在基因调控之下所产生的自然死亡现象，在这一机制下，失去作用或已经受损的细胞会自我毁灭。在抗肿瘤的研究中对抑癌基 因是如何调控肿瘤细胞的凋亡研究最多。P53是目前公认的与肿瘤发生发展相关性最高的抑癌基因之一，近年新发现的ASPP蛋白家族是P53的凋亡刺激蛋 白，对P53起调控作用。ASPP家族与P53作用总的机制为:ASPP与P53结合形成ASPP-P53复合物作用于原凋亡基因启动子，ASPP的微小 变化就可引起P53结合DNA的能力发生改变，从而影响P53诱导凋亡的能力。ASPP1、ASPP2与iASPP作用相反，iASPP是与ASPP1和 ASPP2竞争与P53的结合位点，影响ASPP-P53复合物与DNA结合的能力，从而阻止P53的细胞凋亡功能。
Liu等研究发现在白血病细胞中ASPP1和ASPP2的mRNA低表达与iASPP高表达共存的现象，提示了ASPP1和ASPP2的表达升高和下调iASPP的表达也许在治疗白血病发病机制中起重要作用。
Lossos等用RT-PCR和免疫组化等方法对弥漫性大B淋巴细胞瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FCL)进行研究，发现AS-PP1表达高的患者存活时间长，而ASPP1表达低的患者存活时间短。
以上研究证明，ASPP蛋白是体内p53的关键调节蛋白，AS-PP1和ASPP2通过提高原凋亡基因的活力促进P53依赖的细胞死亡。由于目前相 关文献较少，对ASPP蛋白家族的认识尚在初步阶段，所以还需进一步研究和认知。本研究的实验数据显示了ASPP1的表达与结肠癌组织学分化程度、浸润深 度及淋巴结转移等临床病理学因素的关系。有文献报道，在正常成人组织中，ASPP1有高表达，而癌组织中，ASPP1表达下降，这与本研究结果部分相符 合。本实验结肠癌组织与正常结肠组织中ASPP1的表达情况如下:结肠癌组织中ASPP1的阳性表达率为86.7%，正常结肠组织中ASPP1的阳性表达 率为93.3%，结肠癌组织中ASPP1阳性表达率较正常结肠组织低，但两者比较分别无显著差异性(P＞0.05)。本实验研究结果可能与国内其他学者的 研究结果部分不一致，导致这一结果的原因可能与标本数目较少及地区差异有关，还需增大样本量继续研究与探讨，寻找特异性较好的指标，为结肠癌的预后评估及 合理的综合治疗等提供有力的理论依据。随着对肿瘤研究的深入，ASPP家族可以作为肿瘤早期诊断、治疗和预后判断的一个新靶点。即可以考虑通过提高 ASPP1，ASPP2的高表达，抑制iASPP的表达来提高野生型P53诱导细胞凋亡的功能，达到促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的作用。（来源：期刊）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271115.html
(by admin)
2014-10-27