长期以来由于人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）基因的快速变异导致现有的抗HIV 临床用药治疗效果有限，因此科学家将目光转向宿主细胞中某些与病毒复制密切相关的蛋白，寻求更加有效的抗HIV 策略。随着研究的不断深入，越来越多人体内源性抗HIV 病毒因子被发现，尤其是天然免疫系统在抗HIV 过程中发挥的作用引起高度关注。基于这些研究成果，利用人体自身的免疫系统来抵抗、治疗获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的理念逐渐被认可。
天然免疫系统是人体抵抗病原入侵的第一道防线，能快速识别病原体，产生Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）以及其他相关细胞因子，有效抑制感染进程发挥抗病毒作用。干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING） 是调控Ⅰ型IFN 基因表达的重要接头蛋白，目前研究发现的胞内双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）识别受体均通过STING 蛋白介导产生Ⅰ型IFN。但这些受体识别dsDNA 后如何传导信号激动STING 尚不清楚。2013 年Gao等发现胞内DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosph-ateadenosine monophosphate synthase，cGAS）在DNA作用下，催化合成的内源性分子cGAMP 能直接激动STING 蛋白二聚体。揭示了cGAS-STING 通路在识别胞质DNA、诱导产生Ⅰ型干扰素、激发人体天然免疫反应过程中的重要作用。引人关注的是HIV 等逆转录病毒能激动cGAS-STING 通路。此研究成果相继发表在Science、Cell 等各大期刊杂志。cGAS-STING 信号通路及其作用机制的发现为AIDS 的治疗提供了新的靶点，为抗HIV 药物的设计合成提供了新的思路。本文拟对这一前沿研究成果加以综述。
1 cGAS 识别dsDNA
2013 年报道发现的cGAS 是由522 个氨基酸序列组成核苷酸转移酶（NTase）家族成员。其蛋白结构与2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-oligoadenylatesynthase 1，OAS1）高度相似。OAS1 能特异性识别胞内双链RNA（dsRNA），而cGAS 主要识别的是细胞质中的dsDNA。对比两者的晶体结构发现，在cGAS的C 端结构域389～405 氨基酸残基之间存在1 个高度保守的锌囊结构，结构内的锌离子主要起维持蛋白结构的作用。该结构是cGAS 识别dsDNA 的两个重要位点之一，抑制其正常功能将导致cGAS无法识别dsDNA。cGAS 氨基酸残基R150 和R192插入到了DNA 与cGAS 结合后的DNA 双螺旋空隙中，进一步稳固cGAS-DNA复合体。此外，从cGASDNA的晶体结构发现，cGAS 主要与DNA 的磷酸-核糖骨架结构相互作用，即cGAS 识别dsDNA 不依赖核苷酸的序列组合。合理解释了cGAS能够识别几乎所有类型的DNA 的原因。
cGAS 的蛋白结构中dsDNA 与处于cGAS 平台结构上的两个结合位点结合后，引发cGAS 结构发生变化，激活ATP 和GTP 发生二聚生成环状二聚核苷化合物cGAMP 的酶促反应。被dsDNA 激活后，cGAS 两侧肽链向内收缩，使得氨基酸残基能与进入到口袋中的ATP 或GTP 发生氢键等作用，特异性识别ATP或GTP，促进cGAMP 的合成。cGAMP的合成分两步进行：首先，在定位于E200上的Mg2+作用下，GTP核糖上2'-OH进攻ATPα位磷酸酯，形成2'-5'-磷酸二酯键，生成pppGp（2'-5'）A；同样在Mg2+的作用下，二聚后的ATP 和GTP发生环合，进攻模式类似，但形成的是3'-5'-磷酸二酯键，最终生成Gp（2'-5'）Ap（3'-5'）。真正意义上，cGAMP 存在4 个同分异构体，一般情况下cGAMP指代Gp（2'-5'）Ap（3'-5'）。
2 激动STING 蛋白诱导产生Ⅰ型干扰素
STING 蛋白于2008 年先后被3 个独立的课题组报道发现，是Ⅰ型IFN 生成过程中的中心蛋白。在人体中STING 蛋白主要分布在免疫相关的组织细胞中，如在胸腺、心、脾、胎盘、肺及外周血白细胞中高表达，而在脑部、骨骼肌、小肠、肝、肾及结肠等组织器官表达较少；在HEK293 肾胚胎细胞、A549肺癌细胞、THP-1 单核细胞、U937 淋巴瘤细胞等个别细胞中高表达。
人源STING 基因编码379 个氨基酸，鼠源STING基因编码378个氨基酸，两者相似度达81%。STING 蛋白包括定位于膜上含4 个跨膜结构的N端结构域（N-terminal domain，NTD）和暴露在细胞质中的球状C 端结构域（C-terminal domain，CTD）。人源STING 蛋白138-379 位氨基酸为CTD，包括152-173 位的二聚结构域（dimerization domain，DD）和C 端尾部结构（C-terminal tail，CTT），其中DD 区域为疏水结构域。Ouyang等观察分离纯化得到的STING蛋白CTD，发现蛋白在DD区发生聚合，呈二聚状态。现阶段公布的蛋白晶体结构中，多为STING 蛋白二聚体，STING 蛋白二聚是产生IFN 的必要条件。聚合后的STING 蛋白处于自我抑制状态，当受到诸如cGAMP、cdi-GMP等化合物的刺激后构型发生变化，CTT暴露在外，STING蛋白被激活。激活后的STING二聚体能够将细胞质中的TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1） 招募至CTD 上，并介导TBK1 对IRF3 的磷酸化过程。值得注意的是在所有的cdi-GMP 或cGAMP 与STING蛋白复合物的晶体结构中均没有出现CTT部位。这可能是CTT 结构为可移动结构，也有可能是该结构在STING 激活过程中出现了降解现象。也有报道发现CTT结构缺失的STING 蛋白也能招募TBK1。静息状态下的STING 蛋白主要定位于内质网上，也有部分定位于线粒体上。激动状态下的STING 蛋白将伴随着招募来的TBK、IRF3 等一起滑向靠近细胞核的滑面内质网部位。磷酸化的IRF3在此过程中发生聚合形成二聚体，并向核内转移。进入到细胞核的p-IRF3 刺激相关的DNA 片段，转录合成IFN RNA，分泌到细胞质中最终产生IFN。STING 蛋白以STING/TBK1/IRF3 为轴心模式，与介导了DNA、RNA、病原性小分子诱导的天然免疫反应，从而发挥抗病毒作用。
3 具有激动STING 作用的分子
STING 蛋白在诱导人体天然免疫反应发挥着重要作用，多种DNA、RNA 病毒入侵能激动以STING 为中心蛋白的相关通路。STING 蛋白已经成为了抗病毒药物研究中的一个重要靶点，寻找开发具有SITNG 蛋白激动作用的小分子化合物对抗病毒药物研究意义重大。
在鼠科动物的实验中，小分子化合物CMA能够通过激活鼠源STING，有效诱导产生Ⅰ型IFN。研究CMA 与鼠源STING 蛋白复合物晶体结构发现，两分子的CMA 嵌入到STING 二聚体形成的囊腔中，分子呈平行状态，不存在直接的分子间交叉。分子中的羧基和羰基结构与鼠源STING 蛋白中的Thr226、Arg237 等氨基酸残基发生氢键作用。类似的情况也发生在化合物DMXAA上，除了与鼠源STING 存在氢键作用，DMXAA 母核上的两个邻位甲基作为疏水集团作用于相关的氨基酸残基。
然而，上述类型的化合物却无法激动人源STING 蛋白。这可能是鼠源与人源STING 蛋白氨基酸序列、蛋白结构等方面的差异引起的。这些研究成果为探索发现激动人类STING 蛋白的关键位点具有重大意义。二聚环状核酸类化合物是至今发现的唯一能同时激动人源STING 和鼠源STING 蛋白的分子，包括cdi-GMP、cdi-AMP 及cGAMP 的4 种异构体。
cdi-AMP、cdi-GMP被认为是微生物体内的一种重要的信号传递因子，能以类似V 型直接嵌入到STING 蛋白二聚体的囊腔中。核糖-磷酸酯环嵌入到二聚体底部，两侧的碱基呈近似平行状态。化合物与STING 蛋白二聚体结合后，通过分子间的相互作用，使二聚体的状态更加稳定的同时引发二聚体向内收缩，激动蛋白，诱导产生Ⅰ型IFN。最近发现的人体内源性分子cGAMP 同样能够直接激动STING 蛋白，其激动效果显著强于cdi-GMP。内源性cGAMP 的磷酸二酯键由GMP 核糖2'-OH 与AMP 的5'磷酸及AMP 核糖的3'-OH 与GMP 的5'磷酸聚合而成，因此将此化合物命名为2'，3'-cGAMP。cGAMP 其他3 种同分异构体与STING 同样具有很高的亲和力。其中2'，3' -cGAMP和2'，2'-cGAMP（图2）与STING的亲和力分别为Kd=3.79 和287 nmol/L ， 远强于cdi-GMP（Kd=1.21μmol/L）。此外，cGAMP的4 种同分异构体诱导产生IFN 的能力也强于cdi-GMP，通过qRTPCR测定的EC50为15～42 nmol/L，而cdi-GMP 的EC50值＞500 nmol/L。
从2'，3'-cGAMP 与STING 蛋白二聚体的晶体结构也可以发现在分子-蛋白间的相互作用方面与cdi-GMP-STING 有所不同。前者以U 型形状嵌入到STING 蛋白二聚体中，引发的二聚体向内收缩程度更大。两者与STING 蛋白中氨基酸残基的作用也有着明显不同。cGAMP中鸟嘌呤N7 与R238，鸟嘌呤上氨基与Thr263 都存在直接的作用；特别值得注意的是，c-GAMP 鸟嘌呤碱基7 位N 原子、4 位氨基及核糖3 位羟基分别与Arg238、Thr263 和Ser162 氨基酸残基存在直接氢键作用。
cdi-GMP 中不存在的3'-OH 能与S162 形成氢键作用。分子中2'-OH以及腺苷部分未发现相关氢键作用。而在cdi-GMP 中仅发现鸟嘌呤上N3 以及核糖2'-OH与Thr263 存在直接的氢键作用。由于可激动STING 蛋白的小分子样本太少，对于激动蛋白活性的关键氨基酸位点的争论尚未达成一致认识。最近两个独立的课题组发现了鼠源Arg231（对应人源232 位氨基酸）等位基因突变后的鼠源STINGR231A蛋白不对cdi-GMP 产生应答。进一步的验证发现霍乱弧菌分泌的cGAMP 同样也无法激动该类别的STING 蛋白。在人源STING 蛋白中也发现了同样的情况：232 位Arg 被His 替代后，对细菌分泌的cGAMP 的刺激应答很弱，但却能正常识别人体内源性cGAMP。这一情况可能与人体内源性cGAMP 特有的非经典的2'-5'-磷酸二酯键有关。这些发现依旧没有揭示232 位氨基酸在STING 蛋白激动过程中的作用。同样激活人源STING 蛋白的确切位点未见文献报道。
4 结语
近年来天然免疫系统在抗HIV 等病毒过程中发挥的作用逐渐为人重视，通过激活人体天然免疫系统抵抗HIV 病毒，不但理论上可行而且避开了耐药性问题，同时借助机体自身的反馈调节机制大大降低了药物副反应程度。这一理念已经应用于抗HIV 病毒疫苗的研发中。然而现阶段对于天然免疫系统的认识依旧有限，cGAS-STING 通路是至今发现的为数不多几条能够完整描绘诱导产生Ⅰ型IFN过程的通路。通路中仍有很多细节有待深入探索，如STING 蛋白二聚的具体机制，激动STING 蛋白的关键位点和机制等。对cGAS-STING 信号通路的研究已成为科研领域中的研究热点，新的研究成果将在充实我们对该通路认知的同时，也为抗HIV 药物的研发发掘新的靶点，为AIDS 疾病的治疗提供新的思路。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411161139.html
(by admin)
天然免疫系统是人体抵抗病原入侵的第一道防线，能快速识别病原体，产生Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）以及其他相关细胞因子，有效抑制感染进程发挥抗病毒作用。干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING） 是调控Ⅰ型IFN 基因表达的重要接头蛋白，目前研究发现的胞内双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）识别受体均通过STING 蛋白介导产生Ⅰ型IFN。但这些受体识别dsDNA 后如何传导信号激动STING 尚不清楚。2013 年Gao等发现胞内DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosph-ateadenosine monophosphate synthase，cGAS）在DNA作用下，催化合成的内源性分子cGAMP 能直接激动STING 蛋白二聚体。揭示了cGAS-STING 通路在识别胞质DNA、诱导产生Ⅰ型干扰素、激发人体天然免疫反应过程中的重要作用。引人关注的是HIV 等逆转录病毒能激动cGAS-STING 通路。此研究成果相继发表在Science、Cell 等各大期刊杂志。cGAS-STING 信号通路及其作用机制的发现为AIDS 的治疗提供了新的靶点，为抗HIV 药物的设计合成提供了新的思路。本文拟对这一前沿研究成果加以综述。
1 cGAS 识别dsDNA
2013 年报道发现的cGAS 是由522 个氨基酸序列组成核苷酸转移酶（NTase）家族成员。其蛋白结构与2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-oligoadenylatesynthase 1，OAS1）高度相似。OAS1 能特异性识别胞内双链RNA（dsRNA），而cGAS 主要识别的是细胞质中的dsDNA。对比两者的晶体结构发现，在cGAS的C 端结构域389～405 氨基酸残基之间存在1 个高度保守的锌囊结构，结构内的锌离子主要起维持蛋白结构的作用。该结构是cGAS 识别dsDNA 的两个重要位点之一，抑制其正常功能将导致cGAS无法识别dsDNA。cGAS 氨基酸残基R150 和R192插入到了DNA 与cGAS 结合后的DNA 双螺旋空隙中，进一步稳固cGAS-DNA复合体。此外，从cGASDNA的晶体结构发现，cGAS 主要与DNA 的磷酸-核糖骨架结构相互作用，即cGAS 识别dsDNA 不依赖核苷酸的序列组合。合理解释了cGAS能够识别几乎所有类型的DNA 的原因。
cGAS 的蛋白结构中dsDNA 与处于cGAS 平台结构上的两个结合位点结合后，引发cGAS 结构发生变化，激活ATP 和GTP 发生二聚生成环状二聚核苷化合物cGAMP 的酶促反应。被dsDNA 激活后，cGAS 两侧肽链向内收缩，使得氨基酸残基能与进入到口袋中的ATP 或GTP 发生氢键等作用，特异性识别ATP或GTP，促进cGAMP 的合成。cGAMP的合成分两步进行：首先，在定位于E200上的Mg2+作用下，GTP核糖上2'-OH进攻ATPα位磷酸酯，形成2'-5'-磷酸二酯键，生成pppGp（2'-5'）A；同样在Mg2+的作用下，二聚后的ATP 和GTP发生环合，进攻模式类似，但形成的是3'-5'-磷酸二酯键，最终生成Gp（2'-5'）Ap（3'-5'）。真正意义上，cGAMP 存在4 个同分异构体，一般情况下cGAMP指代Gp（2'-5'）Ap（3'-5'）。
2 激动STING 蛋白诱导产生Ⅰ型干扰素
STING 蛋白于2008 年先后被3 个独立的课题组报道发现，是Ⅰ型IFN 生成过程中的中心蛋白。在人体中STING 蛋白主要分布在免疫相关的组织细胞中，如在胸腺、心、脾、胎盘、肺及外周血白细胞中高表达，而在脑部、骨骼肌、小肠、肝、肾及结肠等组织器官表达较少；在HEK293 肾胚胎细胞、A549肺癌细胞、THP-1 单核细胞、U937 淋巴瘤细胞等个别细胞中高表达。
人源STING 基因编码379 个氨基酸，鼠源STING基因编码378个氨基酸，两者相似度达81%。STING 蛋白包括定位于膜上含4 个跨膜结构的N端结构域（N-terminal domain，NTD）和暴露在细胞质中的球状C 端结构域（C-terminal domain，CTD）。人源STING 蛋白138-379 位氨基酸为CTD，包括152-173 位的二聚结构域（dimerization domain，DD）和C 端尾部结构（C-terminal tail，CTT），其中DD 区域为疏水结构域。Ouyang等观察分离纯化得到的STING蛋白CTD，发现蛋白在DD区发生聚合，呈二聚状态。现阶段公布的蛋白晶体结构中，多为STING 蛋白二聚体，STING 蛋白二聚是产生IFN 的必要条件。聚合后的STING 蛋白处于自我抑制状态，当受到诸如cGAMP、cdi-GMP等化合物的刺激后构型发生变化，CTT暴露在外，STING蛋白被激活。激活后的STING二聚体能够将细胞质中的TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1） 招募至CTD 上，并介导TBK1 对IRF3 的磷酸化过程。值得注意的是在所有的cdi-GMP 或cGAMP 与STING蛋白复合物的晶体结构中均没有出现CTT部位。这可能是CTT 结构为可移动结构，也有可能是该结构在STING 激活过程中出现了降解现象。也有报道发现CTT结构缺失的STING 蛋白也能招募TBK1。静息状态下的STING 蛋白主要定位于内质网上，也有部分定位于线粒体上。激动状态下的STING 蛋白将伴随着招募来的TBK、IRF3 等一起滑向靠近细胞核的滑面内质网部位。磷酸化的IRF3在此过程中发生聚合形成二聚体，并向核内转移。进入到细胞核的p-IRF3 刺激相关的DNA 片段，转录合成IFN RNA，分泌到细胞质中最终产生IFN。STING 蛋白以STING/TBK1/IRF3 为轴心模式，与介导了DNA、RNA、病原性小分子诱导的天然免疫反应，从而发挥抗病毒作用。
3 具有激动STING 作用的分子
STING 蛋白在诱导人体天然免疫反应发挥着重要作用，多种DNA、RNA 病毒入侵能激动以STING 为中心蛋白的相关通路。STING 蛋白已经成为了抗病毒药物研究中的一个重要靶点，寻找开发具有SITNG 蛋白激动作用的小分子化合物对抗病毒药物研究意义重大。
在鼠科动物的实验中，小分子化合物CMA能够通过激活鼠源STING，有效诱导产生Ⅰ型IFN。研究CMA 与鼠源STING 蛋白复合物晶体结构发现，两分子的CMA 嵌入到STING 二聚体形成的囊腔中，分子呈平行状态，不存在直接的分子间交叉。分子中的羧基和羰基结构与鼠源STING 蛋白中的Thr226、Arg237 等氨基酸残基发生氢键作用。类似的情况也发生在化合物DMXAA上，除了与鼠源STING 存在氢键作用，DMXAA 母核上的两个邻位甲基作为疏水集团作用于相关的氨基酸残基。
然而，上述类型的化合物却无法激动人源STING 蛋白。这可能是鼠源与人源STING 蛋白氨基酸序列、蛋白结构等方面的差异引起的。这些研究成果为探索发现激动人类STING 蛋白的关键位点具有重大意义。二聚环状核酸类化合物是至今发现的唯一能同时激动人源STING 和鼠源STING 蛋白的分子，包括cdi-GMP、cdi-AMP 及cGAMP 的4 种异构体。
cdi-AMP、cdi-GMP被认为是微生物体内的一种重要的信号传递因子，能以类似V 型直接嵌入到STING 蛋白二聚体的囊腔中。核糖-磷酸酯环嵌入到二聚体底部，两侧的碱基呈近似平行状态。化合物与STING 蛋白二聚体结合后，通过分子间的相互作用，使二聚体的状态更加稳定的同时引发二聚体向内收缩，激动蛋白，诱导产生Ⅰ型IFN。最近发现的人体内源性分子cGAMP 同样能够直接激动STING 蛋白，其激动效果显著强于cdi-GMP。内源性cGAMP 的磷酸二酯键由GMP 核糖2'-OH 与AMP 的5'磷酸及AMP 核糖的3'-OH 与GMP 的5'磷酸聚合而成，因此将此化合物命名为2'，3'-cGAMP。cGAMP 其他3 种同分异构体与STING 同样具有很高的亲和力。其中2'，3' -cGAMP和2'，2'-cGAMP（图2）与STING的亲和力分别为Kd=3.79 和287 nmol/L ， 远强于cdi-GMP（Kd=1.21μmol/L）。此外，cGAMP的4 种同分异构体诱导产生IFN 的能力也强于cdi-GMP，通过qRTPCR测定的EC50为15～42 nmol/L，而cdi-GMP 的EC50值＞500 nmol/L。
从2'，3'-cGAMP 与STING 蛋白二聚体的晶体结构也可以发现在分子-蛋白间的相互作用方面与cdi-GMP-STING 有所不同。前者以U 型形状嵌入到STING 蛋白二聚体中，引发的二聚体向内收缩程度更大。两者与STING 蛋白中氨基酸残基的作用也有着明显不同。cGAMP中鸟嘌呤N7 与R238，鸟嘌呤上氨基与Thr263 都存在直接的作用；特别值得注意的是，c-GAMP 鸟嘌呤碱基7 位N 原子、4 位氨基及核糖3 位羟基分别与Arg238、Thr263 和Ser162 氨基酸残基存在直接氢键作用。
cdi-GMP 中不存在的3'-OH 能与S162 形成氢键作用。分子中2'-OH以及腺苷部分未发现相关氢键作用。而在cdi-GMP 中仅发现鸟嘌呤上N3 以及核糖2'-OH与Thr263 存在直接的氢键作用。由于可激动STING 蛋白的小分子样本太少，对于激动蛋白活性的关键氨基酸位点的争论尚未达成一致认识。最近两个独立的课题组发现了鼠源Arg231（对应人源232 位氨基酸）等位基因突变后的鼠源STINGR231A蛋白不对cdi-GMP 产生应答。进一步的验证发现霍乱弧菌分泌的cGAMP 同样也无法激动该类别的STING 蛋白。在人源STING 蛋白中也发现了同样的情况：232 位Arg 被His 替代后，对细菌分泌的cGAMP 的刺激应答很弱，但却能正常识别人体内源性cGAMP。这一情况可能与人体内源性cGAMP 特有的非经典的2'-5'-磷酸二酯键有关。这些发现依旧没有揭示232 位氨基酸在STING 蛋白激动过程中的作用。同样激活人源STING 蛋白的确切位点未见文献报道。
4 结语
近年来天然免疫系统在抗HIV 等病毒过程中发挥的作用逐渐为人重视，通过激活人体天然免疫系统抵抗HIV 病毒，不但理论上可行而且避开了耐药性问题，同时借助机体自身的反馈调节机制大大降低了药物副反应程度。这一理念已经应用于抗HIV 病毒疫苗的研发中。然而现阶段对于天然免疫系统的认识依旧有限，cGAS-STING 通路是至今发现的为数不多几条能够完整描绘诱导产生Ⅰ型IFN过程的通路。通路中仍有很多细节有待深入探索，如STING 蛋白二聚的具体机制，激动STING 蛋白的关键位点和机制等。对cGAS-STING 信号通路的研究已成为科研领域中的研究热点，新的研究成果将在充实我们对该通路认知的同时，也为抗HIV 药物的研发发掘新的靶点，为AIDS 疾病的治疗提供新的思路。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411161139.html
(by admin)
2014-11-16