1. 用含LEU 2作为选择标志的酵母菌DNA文库转化lea 2 cdc 101-1酵母菌株,在23℃培养,依据插入片段的大小,筛选2 000~20 000个Leu
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转化体。
2. 影印平板转化体,将其转印到预热的选择性平板,并于37℃培养筛选互补温感突变的表型。过夜培养之后,含插入互补cdc 101-1突变基因片段的质粒的菌落以及含随机非互补质粒的潜在CDC 101
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回复突变体均可能生长。 重新将平板上出现的每个单菌落划线并保存作进一步分析。
3. 用酵母菌候选株取得失去质粒的Leu
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菌株,观察它们在 37℃生长的能力,保留那些能含有质粒时才能在37℃生长的转化子。
4. 从步骤3中确认的转化酵母菌中提取总DNA,分别转化大肠杆菌,从而分离出质粒DNA。重新将质粒DNA转化到突变的酵母菌株中,并证实已分离到正确的质粒。
5. 通过限制性酶切图谱对质粒进行分析,确定出现在不同的质粒中的基因组DNA插入片段是否重叠。这种分析可能有助于确定该互补区的边界。构建不同的插入和缺失突变,检査它们在酵母菌突变株中互补突变的能力。这将为所克隆的插入片段之内部的基因定位提供更精确的信息。
6. 将一个酵母选择性标志引入互补区中央的某一位点(基于步骤5获得的信息)。
7. 将被破坏的质粒再转化到原突变菌株中,并筛选突变表型,检查互补作用是否被彻底破坏。构建含一个野生型基因拷贝和一个被破坏基因拷贝的二倍体菌株。
8. 在孢子形成和剖分后,与含被破坏基因拷贝的单倍体孢子产物(通常靠步骤6引入的选择性标志来找出)与一个含原突变的菌株杂交,如果这个二倍体与原突变株表型相同,说明不存在互补作用,表明与突变相关的基因已被克隆,同时作一个对照实验,将含破坏基因的单倍体(也许它本身也可能表现非野生型表型)与一野生型孢子杂交,去说明这个二倍体表型是野生型的(表明破坏是一 种隐性突变)。
8. 在孢子形成和剖分后,与含被破坏基因拷贝的单倍体孢子产物(通常靠步骤6引入的选择性标志来找出)与一个含原突变的菌株杂交,如果这个二倍体与原突变株表型相同,说明不存在互补作用,表明与突变相关的基因已被克隆,同时作一个对照实验,将含破坏基因的单倍体(也许它本身也可能表现非野生型表型)与一野生型孢子杂交,去说明这个二倍体表型是野生型的(表明破坏是一 种隐性突变)。