4.  加8.25 g 尿素、6.0 ml 水、2.0 ml 30%丙烯酰胺/1.8%亚甲双丙烯酰胺、0.75 ml pH4~8的Ampholytes 两性电解质于一个小的真空瓶中。瓶内加一小搅棒，将瓶子置于磁力搅拌器的温水浴中，搅拌至尿素全溶于水，不要加热使溶液温度超过30℃。

5.  在强真空下脱气2~3 min，加入0.3 ml NP-40，摇晃使之溶解混匀。

6.  将溶液倒入带0.2或0.45 μm 针头式滤器的注射器中，推压使之通过滤器。加入10 μl TEMED，摇匀；再加70 μl 过硫酸铵，摇匀。立即用吸管将溶液加入到凝胶柱管和大的凝胶灌制管之间的空间。

7.  用一洗瓶轻轻地在凝胶往管的外面加入水，直至将丙烯酰胺溶液压进拄管至所设定的高度，放置使凝胶聚合。

8.  取去凝胶灌制管底部的Parafilm膜从底部将含有聚合好凝胶的凝胶管推出，用单刃刀片切去管子底部多余的丙烯酰胺。并在流动的去离子水下冲洗，除去残余的丙烯酰胺。

9.  在每根管子的顶部套上橡皮扣眼，留意在扣眼下仍可看见凝胶的顶部，在扣眼上需留约5 mm 凝胶管。

10.  将凝胶管连同扣眼安装在上缓冲液槽的孔眼中，多余的孔眼用橡皮塞子堵紧。

11.  往下缓冲液槽加入大约3 L 0.085%的磷酸。

12.  将上、下缓冲液槽安放在一起，调整下缓冲液槽使液面盖没凝胶。

13.  上缓冲液槽加入250 ml 0.02 mol/l 的NaOH，用带22G皮下针头的1 ml注射器将凝胶管的顶部用0.02 mol/l 的NaOH充满，小心排去凝胶管中的所有气泡。

14.  连接电源，黑色的导线接于上槽。在200 V 恒压下预聚集1 h 撤开电泳槽与电源的连接。

15.  用50 ml 注射器将10~30 μl 蛋白质样品穿过凝胶管上的缓冲液直接加在凝胶的表面。

16.  盖上上槽盖后，连接电源。打开电源调到设定电压，恒压电泳16 h。

17.  将电压调到零位，关闭电源，结束电泳。用50 μl 注射器往毎根凝胶的顶部加入约1 μl 浓溴酚蓝溶液。

18.  用一个装上了 200 μl 移液器的吸头的注射器,将凝胶用水压从凝胶管中挤出。

19.  将凝胶放入作好标记的小瓶中，凝胶可立即使用或在-70℃放置数周。

20.  凝胶管在铬酸冼液中浸泡过夜，在流动的去离子水中冲冼15 min。吸干管子中多余的水分，使之干燥。