一、ELISPOT包被

1.  设计好实验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

2.  每孔加入15 μL 70%的乙醇预湿30秒。

3.  加入100 μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

4.  按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50 μL，4°C包被过夜。

5.  （次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

6.  加入200 μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

7.  倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。）

二、铺细胞，加入刺激物，培养

整个实验设置一组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。

1.  填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。

2.  取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200 μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。

3.  按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100 μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1x10 ⁵ /well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

4.  加入100 μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

5.  正对照孔加入10 μL PHA，终浓度4 ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

6.  加入实验者自己的刺激物（配制成10×终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。

7.当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。

三、培养后操作

1.  倾倒孔内的细胞及培养基。

2.低渗法将细胞裂解，每孔加入200 μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。

3.每孔用200 μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。

4.按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100 μL生物素标记的检测抗体，37°C1小时。

5.  每孔用200 μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

6.  按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100 μL，37°C1小时。

7.  每孔用200 μLPBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

8.  照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100 μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。

9.  待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

10.  将ELISPPOT板置于ELISPOT自动读数仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。

注意事项