做过PCR的童鞋们都知道要想完全hold该实验、成为真正的PCR达人，并非易事。就qPCR而言，似乎其中的每一环节都可以让整个实验挂掉，也因此成为了资深科研狗们心中的痛。有时，各种假阳性、非特异性带等问题就是挥之不去、不请自来，这个时候该如何是好呢？实践出真知，小鱼就将各位前辈用经验换来的真理分享给大家。

普通PCR常见问题

Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）

Answer：

1. 引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。

2. 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；

3. 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。

Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）

Answer:

1. 条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。

2. DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。

3. 对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。

4. 酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

5. PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。

6. Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。

7. 如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。

Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象

Answer：

1. 当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR

2. 若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度

3. 酶量过多，则适当减少酶量

4. Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度

5. 退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）

6. 循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。

Q4：提高PCR特异性的策略有哪些？

Answer:

四种策略：

1. 巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性

2. 

3. 递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。

4. 热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。

5. 使用PCR增强剂：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但是增强剂的浓度要适当。

Q5:PCR引物设计的一般原则是什么？

Answer：

1. 引物长度：15-30bp,一般为20bp左右。

2. 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。上下游引物的GC含量不能相差太大。A/T/C/G最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

3. 引物结构：避免引物3’端出现互补序列及二级结构，3’端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。

4. 引物中酶切位点一般加在5’端，合适的酶切位点便于后续实验中的酶切分析或分子克隆。

5. 引物浓度：每条引物浓度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物间二聚体的形成机会。

（回复“引物”，可查看引物设计实例教程）

Q6：克隆PCR产物的最优条件是什么？

Answer:

目的片段与载体的最佳比例需依照实验来确定，一般1:1为最佳比，摩尔数比为1:8或8:1也行。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶及目的片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜（可提高链接效率）。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

Q7：PCR产物是否需要凝胶纯化？

Answer:

如凝胶分析扩增产物中只有一条带，则无需凝胶纯化。若是有大量的引物二聚体，则需在克隆前进行凝胶纯化。

Q8：没有回收到目的片段，需要做什么对照实验？

Answer:

1. 涂布未转化的感受态细胞，如有菌落，表明氨苄霉素失效，或有氨苄抗性的杂菌污染。

2. 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。转化率=产生菌落的总数/铺板DNA总量，铺板DNA总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。例如将1ul的质粒（1ug/ul）用于100ul感受态细胞转化。再将1ul转化后的感受态细胞稀释至1000ul后（含有10ng DNA），用100ul铺板（含有1ng DNA）。过夜培养后得到了1000个菌落。转化率=1000菌落数×103ng/铺板1ng DNA=106cfu/ug。低于108cfu/ug，转化效率低，应重新进行细胞转化。

3. 如用pGEM-T作为阳性对照，产生了超过20-40个蓝斑，表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶，需更换核酸酶。

Q9：对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

Answer:

1. 目的片段不适合连接。因用凝胶纯化的目的片段在受到UV过度照射时会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必须重新纯化。

2. 如PCR反应体系的DNA聚合酶若带有修复功能，则扩增产物末端无碱基A（该碱基是pGEM-T载体克隆所需的）。可将酶更换为Taq DNA聚合酶。

3. 高度重复序列可能会不稳定，在PCR扩增中产生缺失和重排。如若目的片段高频率的产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。

qPCR的疑难杂问

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Q10：如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？

Answer:

1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。

2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂

3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

6. 设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

Q11：避免RNA降解的方法有哪些？

Answer:

1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA

2. 使用良好无污染技术分离RNA

3. 将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

Q12:RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？

Answer:

逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

Q13：如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分？

Answer:

确定退火温度适合实验中所用的引物。如随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10min。

Q14：如何减少RNA模板中的二级结构？

Answer:

1. 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火；提高逆转录反应温度。

2. 温度超过60℃时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP

3. RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65℃。

Q15：RNA中有DNA污染的处理方式

Answer：

1. 若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。

2. 若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。

Q16：qPCR探针设计的一般原则有哪些？

Answer:

1. 扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp。

2. 探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp。

3. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度

4. 探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部

5. 探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。

Q17：在无反转录酶的情况下，对照RNA仍获得扩增结果

Answer：

1. 体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。

2. 可能是引物二聚体的条带。

Q18：扩增产物滞留在加样孔中

Answer：

1. 可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。

2. 在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

Q19：无Ct信号出现

Answer：

1. 反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。

2. 检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

3. 引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。

4. 模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。

Q20：Ct值出现过晚（Ct>38）

Answer：

1. 扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。

2. 反应成分降解或加样量不足

3. PCR产物过长，一般采用80-150bp.

Q21：标准曲线线性关系不佳

Answer：

1. 加样存在误差，是样品浓度不成梯度。

2. 标准品出现降解，避免反复冻融。

3. 引物或者探针设计不佳。

4. 模板中存在抑制物或模板浓度过高。

Q22：溶解曲线存在多个主峰

Answer：

1. 引物设计不够优化。

2. 引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。

3. 镁离子浓度过高。

4. 模板基因组的污染。

Q23：同一样品中，其中某一个荧光信号特别强。

Answer:

1. 试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。

2. 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

3. PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。

Q24：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？

Answer：

1. 反应过程中电压不稳定

2. 可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强

3. 如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。

Q25：部分样本扩增效率过低？

Answer:

1. 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应

2. 反应液未严格取量混匀或分装不均匀

3. 试剂失效

Q26：阴性对照或空白对照翘尾

Answer：

1. 模板提取环境或操作过程有污染

2. 配液过程存在污染

Q27：直线型扩增曲线

Answer：

1. 探针部分降解：一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。

2. 反应液中有PCR抑制物。

Q28：没有扩增曲线

Answer：

1. PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段

2. 电脑设定了自动休眠

Q29：基线下滑

Answer：

基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。

Q30：扩增曲线断裂

Answer：

基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值<15，而基线范围仍取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct前4个循环，重新分析数据。

Q31：样品浓度跨度过大

Answer：

样品浓度过高，导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，其解决方法同“扩增曲线断裂”。

Q32：山坡形曲线

Answer：

常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。

来源：解螺旋

2016-06-15