重组蛋白纯化中去除亲和标签蛋白酶总结

异源蛋白在大肠杆菌中大量表达是研究基因和蛋白功能的重要手段。异源蛋白由于来源广泛,其所使用的密码子常常与大肠杆菌有着显著的不同,因而不能分泌至细胞间质,即不能以可溶性蛋白而仅能以包涵体的形式表现出来,这一点在表达真核生物基因时尤为明显。 解决异源蛋白可溶性的手段之一是将目的基因和融合标签进行融合表达。常用的融合标签有麦芽糖结合蛋白( MBP) 、泛素样修饰蛋白( SUMO) 、氮源利用物质A( NusA) 和谷胱甘肽转移酶( GST) 等。 融合标签也有可能增加目的蛋白的产量。常在融合标签和目的蛋白之间设计蛋白酶的酶切位点以通过蛋白酶的酶切将二者分开。常用的蛋白酶包括TEV蛋白酶、凝血酶、肠激酶等,其中以TEV 蛋白酶最为重要。

下表为常用的蛋白酶性质及识别位点

内切蛋白酶

酶名称

来源

分子量

融合标签

抑制剂

识别位点

备注


Enteropeptidase

肠激酶(EK)

Duodenum.

E. coli.

S. cerevisiae.

110 + 35 kDa

His6

还原剂

DDDDK↓

P1′ ≠ Pro, Trp.

35 kDa轻链会自激活


Thrombin

凝血酶

Plasma.

CHO cells.

32 + 4.5 kDa

none

还原剂

LVPR↓GS



Factor Xa

凝血因子Xa

Plasma.

HEK 293 cells.

42 + 17 kDa

none

还原剂

螯合剂

磷酸根离子

LVPR↓GS

非常混乱


TEV Protease

TEV蛋白酶

E. coli.

27 kDa

His6

MBP

GST

Strep II

巯基烷基化剂

ENLYFQ↓G

P1′ can vary.

P2′ ≠ Pro.

Ac-TEV? = S219V

mutant.


Rhinovirus 3C Protease

鼻病毒3 c蛋白酶

E. coli.

27 kDa

His6

GST

His6-GST

巯基烷基化剂

LEVLFQ↓GP

Same as PreScission?

Protease.

外切蛋白酶

Carboxypeptidase A

羧肽酶A

Pancreas.

E. coli.

S. cerevisiae.

S. frugiperda (baculovirus).

33 kDa

His6

还原剂

螯合剂

从蛋白的C末端切除,遇到Pro,Lys和Arg则不切除。

Asp, Glu, Gly cleaved

slowly.


Carboxypeptidase B

羧肽酶B

Pancreas.

E. coli.

P. pastoris.

35 kDa

none

还原剂

螯合剂

蛋白C末端的赖氨酸和精氨酸

 

在特定条件下会切除疏水氨基酸

 


DAPase

Kidney.

S. frugiperda (baculovirus).

23 + 16 + + 6 kDa

His6

还原剂

巯基烷基化剂

从N端开始每次2个氨基酸成对切除

P2 ≠ Pro, Lys, Arg.

P1 ≠ Pro.

带有融合标签的表达产物--融合蛋白的纯化通常也是紧接细胞破碎工作进行的。设计融合标签的主要目的之一就是为了方便后继的亲和纯化。目前最为流行的融合标签自然是His-Tag,和GST,来自GE Healthcare(原安玛西亚)、Qiagen,Novogen,Sigma等公司都有质量非常稳定可靠的产品,种类还特别丰富,分别对应不同的上样量和工作压力和流速的需要。

融合蛋白纯化后,虽说有的Tag如HisTag很小,可以不用去除。可有的情况下,还是要去除Tag的。去除Tag的方法无非是利用融合蛋白设计的蛋白酶切位点,比如Xa因子,肠激酶,凝血酶等等切除。忍不住唠叨一下,这些蛋白酶识别位点虽然比较专一,但是酶切效率也和目标蛋白构象有关,浓度过高还是有可能导致非目标切割的,因此无论如何实验前需要用不同浓度和反应时间做预实验摸条件 的,PAGE检测酶切效果后再放大实验。至于Xa因子,肠激酶,凝血酶哪个好用,首先是要看你的目标蛋白里有没有类似的酶切位点,有的就不能用。

切下来的Tag再过一下亲和 柱就可以去掉,问题是蛋白酶切引入的那一点点蛋白酶呢?所以你一定要买经过修饰的蛋白酶,以便后继实验中的去除。


Souce: 纽普生物    2016-07-11