利用X射线衍射法研究生物大分子结构，最困难的常常是晶体的获得。目前，生物大分子单晶的培养还没有上升到理论高度，主要依赖于经验。

影响生物大分子结晶的因素

1. 待结晶物质的纯度：一般来说要求待结晶物质的纯度越高越好；除了纯度，还要关注微观层面上的构象均一性和化学均一性。

2. pH值：pH值能影响蛋白的溶解度，甚至有时候会一起蛋白变性。需要根据蛋白性质选择合适的pH值，有时候不同pH值条件下会得到不同晶型的晶体。

3. 沉淀剂：沉淀剂的加入可以改变溶液中生物大分子之间的相互作用力，即可以改变生物大分子在溶液中的溶解性，促进生物大分子在溶液中的有序凝集而结晶。

4. 温度：结晶的过程可以发生在0-40摄氏度的整个范围内。但通常都在4度冷室或则25度室温进行。在低离子强度下大部分蛋白质的溶解度在室温比低温时大。

5. 待结晶物质的浓度：母液中生物大分子的浓度通常应该尽量的高，文献报道的从1mg/ml到几百mg/ml的浓度范围内都有晶体长出，最常用的是5-30mg/ml。

6. 金属离子：有许多金属离子具有诱导或者促进不同大分子结晶的能力。所采用的金属离子在许多情况下是生物活性所必须的。

7. 震动：一般认为震动不利于结晶形成，但也不是绝对。

蛋白样品的准备

1.蛋白纯度

一般来说蛋白结晶要求纯度越高越好，从SDS-PAGE上判断要>90%的纯度。有时候融合蛋白（GST）的存在能促进蛋白结晶。

2.蛋白溶解性

蛋白质浓度是制约蛋白质结晶的因素之一，较高的浓度能使蛋白分子间产生更多的碰撞聚合机会进而形核生长。研究发现在非同源且溶解度差的6种蛋白质中加入浓度为50 mmol/L带正电的L-Arg和L-Glu后，这些氨基酸可以与蛋白质表面残基结合，覆盖蛋白质表面疏水区，增加蛋白质可溶性，其溶解度最高可以提高8.7倍并生长出高质量晶体。另外，某些蛋白质由于表面疏水导致可溶性差，当引入可溶性基团后覆盖其疏水表面可提高蛋白质亲水能力。有研究发现，在溶解度低的蛋白质的N端或C端引入3个Lys，可以大幅度提高蛋白质的溶解度。

3.蛋白质的均一性

3.1化学均一性：即蛋白质聚集状态的均一性（比如单体，二聚体，三聚体，N聚体的同时存在）。在蛋白质中加入一定浓度的Arg和Glu可以有效地防止蛋白聚集和沉淀发生，从而使蛋白质溶液更均一，并且提高了蛋白质的长期稳定性。

3.2构象均一性：如糖基化现象和高度灵活区（highly flexible）的存在导致蛋白质构象不均一和电荷的多样性，影响蛋白质的结晶。所以有时候需要用糖苷酶对蛋白进行脱糖基化，消除了它们构象上的不均一性及所附糖链的灵活性，才能获得高质量晶体。许多蛋白质含有高度灵活区甚至完全未折叠的片段，干扰了结晶过程。为获得稳定的蛋白质结晶样品，通常采用切除多肽链N端或C端的灵活区和分子内部的Ω环等手段来解决。

4.蛋白表面修饰

蛋白质结晶是一个熵减的过程，某些含有带电 的Lys和Glu的蛋白质，其表面残留较高的熵值，阻碍晶格有序排列，无法进行结晶，因此有必要对其进行修饰改造。一种修饰方法是用熵值低的氨基酸替代熵值高的氨基酸，Swagata证实，对于某些难以结晶的蛋白质，用Arg替代Lys可以使蛋白质更易结晶。另一种修饰方法是自由氨基基团的还原甲基化，将Lys残基修饰为叔胺，可降低表面熵值。

5.蛋白质溶液的pH

一般来说，溶液的pH值在蛋白质的等电点附近时，蛋白质溶解度最低，此时静电荷为零，排斥力最小，有利于结晶。也有研究表明，蛋白质是一种非常复杂的多离子体，因此会产生多个最小溶解度点，所以在远离蛋白质等电点时也会生长出晶体。Kantardjieff等分析了PDB数据库中9596种不同的蛋白质，成功地计算出最适结晶的pH值与蛋白质等电点的关系。虽然当pH值接近或等于等电点时有利于形成晶体，但此时往往不是最佳结晶的pH值，经统计得出，pH值为等电点的一半时为最佳pH值。

Souce: 纽普生物    2017-12-27