限制性酶克隆是分子克隆的主力军，但其最大的局限是只能在限制性酶切位点进行序列修饰。λ-Red系统源自λ-Red噬菌体，λ-Red利用同源重组技术可以摆脱限制性内切酶的酶切位点限制，可用于进行各种改造：插入和删除序列、点突变或其他小的碱基对变化，以及添加蛋白质标签。它还能灵活修改细菌染色体、质粒 DNA 或 BAC DNA（细菌人工染色体）。
要使用λ-Red重组系统改造目标DNA，首先要将线性供体DNA底物（dsDNA或ssDNA）电转化到表达λ-Red酶的大肠杆菌中。然后，这些酶催化底物与目标 DNA 序列的同源重组。这意味着克隆是在体内进行的，而限制性酶克隆的基因改变是在试管中进行的。供体 DNA 底物只需与目标位点有约 50 个核苷酸的同源性即可进行重组。
通常情况下，在大肠杆菌中线性DNA片段很难转化成功，这是因为大肠杆菌含有RecBCD酶，它是细菌内源性重组系统的重要组成元件，既可以通过同源重组修复双链DNA断裂，又可以降解线性DNA。因此，想要在大肠杆菌中实现外源性双链DNA与靶序列的同源重组，就必须抑制细菌内源性的同源重组系统对线性dsDNA的降解能力。
目前λ-Red重组系统已经成功的应用在大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森氏菌等细菌中。
λ-Red系统的三个关键组分
λ-Red系统包含三个关键组分：Exo、Beta和Gam；如果导入细菌的是dsDNA，那么这三个组分都是必须的；如果导入细菌的是ssDNA，只需要Beta就行。具体原因，我们下面细说。
Gam：Gam蛋白大小为16kDa，可以与RecBCD核酸外切酶和SbcCD核酸内切酶结合，分别形成RecBCD-Gam和SbcCD-Gam复合物，进而抑制RecBCD和SbcCD的核酸酶活性，从而避免通过电转进入大肠杆菌细胞内的外源线性dsDNA片段被降解掉。
Exo：Exo是个5’→3‘双链DNA依赖的核酸外切酶，单亚基的分子量为24kDa, 这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链 DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo 蛋白可结合在双链DNA的末端，沿着5'-3'方向降解外源dsDNA，这样会在外源dsDNA两端各产生一段3’ overhang。如果dsDNA比较短，互补链被完全降解，产物也有可能只是一段ssDNA了。
Beta：单亚基的分子量为25.8kDa。在细胞中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA 3’突出端（由Exo产生的3’ssDNA overhang或者电转导入的ssDNA oligo），防止DNA被单链核酸酶降解，促进外源dsDNA片段与基因组靶标位置的同源序列发生退火配对。
λ-Red系统的三个关键组分（图片来源：addgene）
利用λ-Red同源重组将把基因替换成抗性基因的示意图（图片来源：addgene）
λ-Red系统关键组分的表达
λ-Red系统关键组分的表达有四种途径：
1. 细菌中整合有缺陷型的λ-噬菌体。比如DY380菌株，这些菌株中的exo、beta和gam基因的表达受内源λ-噬菌体启动子pL和抑制子CI的严格调控。DY380来源于DH10B菌株，它含有一个温度敏感型的抑制子λ‐cI857。在42℃培养的时候（15min即可），λ‐cI857失活，导致exo、beta和gam的表达，因此可以发生重组。在低温（30-34˚C）的时候，抑制子又恢复活性，从而抑制red基因的表达，进而抑制重组。
2. 表达质粒。这些表达red基因的质粒也需要受到严格的表达调控，常用的有IPTG诱导的lac启动子（对应的抑制子是lacI）、阿拉伯糖诱导的pBAD启动子（对应的抑制子是araC）还有内源的pL启动子（对应的抑制子是cI857）。阿拉伯糖诱导的pBAD启动子如pKD46载体就是一个常用的表达质粒（图谱如下）。使用质粒表达λ重组系统最适合用于编辑细菌染色体DNA，因为一旦产生重组克隆，可以很容易去除重组系统。一个简单的方法是用具有热敏感复制子的质粒表达λ-red基因。 比如pKD46载体用的就是一个温度敏感型的复制子pSC101。pSC101的复制需要Rep101蛋白，而Rep101是个温度敏感型的蛋白，当温度高于37℃时，质粒发生丢失，所以含pKD46的菌株需要在30℃（不要超过32℃）进行培养。
pKD46质粒图谱
3. Mini-λ
mini-λ是一种复制缺陷型的环状的噬菌体DNA片段。当mini-λ导入细菌时，它可以整合到基因组上。mini-λ使用内源的red启动子pL和cI857调控表达。可以用抗性对整合了mini-λ的克隆进行筛选。当培养问题上调至42℃时，cI857失活，重组发生。与此同时，int和xis基因表达，这两个基因的表达会促使mini-λ从宿主染色体上被切除，这时候mini-λ可以像质粒一样被提取出来。
4. λ-噬菌体
使用带四环素抗性和温度敏感型抑制子cI857的λ-噬菌体。这种方法适合修改质粒或者细菌人工染色（BAC），因为噬菌体导入细菌后，它会稳定整合到基因组中。
dsDNA还是ssDNA？
dsDNA底物适合用于删除或者插入超过20nt的片段，而ssDNA底物则适合用于点突变或者只修改少数几个核苷酸。
dsDNA可以通过PCR来制备，简单来说就是合成两条~70nt的引物（其中20nt与要扩增的DNA退火，另外50nt则插入位点侧翼退火）来扩增目的DNA片段。用dsDNA的重组效率约10-5-10-4。
ssDNA则可以通过直接合成引物或者将短的PCR产物进行变性。无论哪种方式，ssDNA长度最好是70-100nt，所需改变的位点位于ssDNA中心。由于以 DNA 的滞后链为目标时，λ Red重组的频率较高，因此最好先确定您感兴趣区域的复制方向，然后设计与滞后链互补的寡聚核苷酸。实践中，可以设计针对两条链的寡聚核苷酸，这样就不用判断目标区域的复制方向了。 这两种寡聚核苷酸中的一种会比另一种以更高的效率进行重组，您将根据经验找出哪条是滞后链。ssDNA的重组频率比dsDNA要高，约0.1-1%，特定情况下可以达到25-50%。
与λ-Red重组相关的质粒
pKD46，氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD46-Tet，四环素抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD20，氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pREDKI，卡那抗性，表达I-SceI（受pRha启动子调控）, 阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶。
pKDsgRNA-ack 阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶，四环素诱导转录sgRNA
pREDCas9：携带针对氨苄基因的gRNA
pKD13，提供卡那霉素抗性重组模板，卡那霉素抗性基因两端带FRT序列。
pKD4，提供卡那霉素抗性重组模板，卡那霉素抗性基因两端带FRT序列
pKD3，提供氯霉素抗性重组模板
pCP20：氯霉素和氨苄抗性，FLP重组酶消除抗性。当我们敲入片段的时候通常会带一个抗性基因以便于筛选阳性克隆，在抗性基因的两端加上FRT片段，就能在FLP酶的作用下使得抗性基因被切除掉。pCP20也是温敏型质粒，在42℃培养会丢失。
Souce: 纽普生物 2024-08-06