背景知识
针对双链断裂（DSB，Double-strand DNA breaks）细胞主要启动两种“DNA修复”细胞信号转导通路：HDR与NHEJ。
HDR同源重组修复 （Homology directed repair )： 是在两个相似或相同的DNA分子核苷酸序列之间交换的一种遗传重组，并且在断端不会出现核苷酸缺失或增加，能精确地修复DNA双链的断裂。
NHEJ非同源末端连接 （non-homologous end joining )：断端会经过核酸酶的修剪和DNA聚合酶的填平空隙，所以DSB修复的DNA会有“伤痕”，可能是修复合成时新加入几个核苷酸或切除一些核苷酸；因此，在损伤末端重连处，一般会有几个核苷酸或几对碱基对的“伤痕”。
“伤痕”如果是在基因组的编码蛋白基因部分，至少有三分之二以上的概率会产生翻译的移码，从而翻译后的蛋白其功能也相对应产生异常。
“伤痕”如果是在基因组的非编码区的话，这对细胞可能没有大的影响。
NHEJ的修复是快速非精确的，过程中可能会随机的引入和去除几个碱基，整个细胞周期都有发生，在G1期及S期发挥着重要作用；HDR的修复是复杂而精确的，但是需要同源序列模板，只能发生在细胞G2/S期。针对不同DSBs损伤类型机体会选择性的启动NHEJ或HR修复机制，拯救已经受伤的DNA。
I-SceI
I-SceI是酿酒酵母内含子编码的核酸内切酶（Intron-encoded endonuclease I-SceI），特异性识别并切割序列：5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'
I-SceI识别序列及切割位点
由于I-SceI识别的位点有18bp长，因此它在基因组中出现的频率极低，约7×1010随机碱基才会出现一次，相当于20种哺乳动物基因组中才会出现一次。
因此I-SceI常用于细胞中引入双链断裂（DSB）及DSB修复机制的研究。
同源重组修复检测系统：
基于pDRGFP质粒的一项同源重组修复检测系统研究[1]，pDRGFP质粒图谱如下：
图谱中蓝色标记的两段序列相同，红色标记的两段序列相同。SceGFP由于插入了I-SceI位点（前三个碱基tag就是个终止密码子），使得SceGFP不能发荧光。同时iGFP也并非完整荧光蛋白，而且不被转录，所以它也不会发荧光。
当加入I-SceI核酸酶的时候，SceGFP产生DSB断裂，刺激修复途径激活，以iGFP为供体片段的同源重组修复事件修复断裂的SceGFP进而恢复荧光蛋白的表达。
非同源末端连接检测系统：
启动子通过一个puro基因与GFP编码盒分离，puro基因两侧是两个具有相同方向的I-SceI位点，当加入I-Sce I核酸内切酶时，puro基因被切除，NHEJ修复两个I-SceI诱导的DSB，I-SceI识别位点之间的末端连接可恢复GFP的表达。NHEJ修复后产生两种可能的结果，一种是I-SceI识别位点被恢复（I-SceI+），另外一种是I-SceI识别位点被破坏（I-SceI-）。
基于pimEJ5GFP质粒的非同源重组修复的研究[2]。
与其他同源重组技术的结合应用
当Red重组和I-SceI结合起来就可以用来删除Red重组引入的抗性基因，只需要在抗性基因的两端都加上I-SceI位点，然后加入一个温敏型的I-SceI酶表达质粒，I-SceI酶就会把Red重组所引入的抗性基因删除，同时产生DSB断裂，然后内源的修复机制修复DSB。pREDKI质粒就可以实现上述功能，pREDKI质粒由阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶，同时L-鼠李糖诱导表达I-SceI。
参考文献
1. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999 Oct 15;13(20):2633-8. doi: 10.1101/gad.13.20.2633. PMID: 10541549; PMCID: PMC317094.
2. Bennardo N, Cheng A, Huang N, Stark JM. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 2008 Jun 27;4(6):e1000110. doi: 10.1371/journal.pgen.1000110. PMID: 18584027; PMCID: PMC2430616.
Souce: 纽普生物 2024-08-07