引言
在当今生物化学和生物技术的前沿领域，荧光多肽作为一种强大而多功能的研究工具，正发挥着日益关键的作用。它不仅为深入探索生物过程的奥秘提供了精细的窗口，还为疾病的诊断、治疗和药物研发等领域带来了创新的思路和方法。对于科研人员而言，全面了解荧光多肽的特性、制备方法、应用领域等，具有重要的意义。
什么是荧光多肽
荧光多肽是由氨基酸组成的短链分子，通过化学修饰或与特定的荧光染料共价结合，从而获得在特定波长光激发下发出荧光的独特性质。这种荧光特性使得它们能够在微观尺度下被精确检测、追踪和定量分析。
荧光多肽的制备方法
1. 化学合成
1.1 固相肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis，SPPS）：这是一种广泛应用的方法。在SPPS中，多肽链从固相载体上逐步延伸，通过一系列的化学反应添加氨基酸。在合适的步骤，可以引入具有活性官能团的氨基酸，然后与荧光染料进行偶联反应。例如，使用含有氨基的赖氨酸残基与含有羧基的荧光染料（如FITC）反应，形成稳定的酰胺键，从而实现荧光标记。
1.2 液相肽合成（Liquid Phase Peptide Synthesis，LPPS）：在液相中进行肽键的形成和修饰。比如点击化学、酰胺键连接和马来酰亚胺反应等。
点击化学：点击化学反应反应涉及一个炔烃（通常与多肽相连）和一个叠氮基团（通常与染料相连）。点击化学是一种选择性强、有效、快速、定量、在水中进行且易于操作的连接方法。
酰胺键连接：荧光基团可以通过羧基或者NHS（N-Hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺）与多肽游离氨基形成酰胺键。
马来酰亚胺反应：马来酰亚胺（染料，Maleimide）与自由巯基（多肽）形成共价键连接。
2. 生物合成
2.1 基因工程：将编码目标多肽和荧光蛋白的基因序列融合，然后导入合适的表达系统（如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞）中进行表达。这种方法能够产生具有天然构象和活性的融合蛋白，但需要对基因进行精确的设计和优化，以确保荧光蛋白与多肽的正确连接和功能。
2.2 无细胞蛋白质合成系统：利用从细胞中提取的成分，在体外构建蛋白质合成环境。这种方法可以快速合成荧光多肽，并且避免了细胞内复杂的代谢和调控过程对合成的影响。
荧光多肽的荧光特性
1. 激发波长和发射波长
1.1 不同的荧光基团具有特定的激发和发射波长范围。例如，常见的荧光染料FAM（羧基荧光素）的激发波长约为495纳米，发射波长约为520纳米；而Alexa Fluor 488的激发波长为488纳米，发射波长为519纳米。这些特性决定了在实验中所使用的激发光源的波长和检测设备的检测窗口。
1.2 一些新型的荧光染料，如量子点（Quantum Dots，QDs），具有较宽的激发光谱和窄而对称的发射光谱，可以通过调节其尺寸和组成来精确调控激发和发射波长。
2. 荧光强度
2.1 多肽的结构对荧光强度有显著影响。二级和三级结构的形成可能会影响荧光基团的暴露程度和周围环境的极性，从而改变荧光强度。例如，当荧光基团位于多肽的内部，受到周围氨基酸残基的屏蔽作用时，荧光强度可能会降低；而当荧光基团暴露在表面，与溶剂充分接触时，荧光强度可能会增强。
2.2 环境因素，如pH值、离子浓度、温度和溶剂性质等，也会对荧光强度产生重要影响。以pH值为例，某些荧光染料在酸性或碱性条件下可能会发生质子化或去质子化，导致荧光强度的改变。离子浓度的变化可能会影响荧光基团与周围分子的静电相互作用，进而影响荧光强度。温度的升高通常会导致分子的热运动加剧，增加非辐射跃迁的几率，从而降低荧光强度。溶剂的极性和折射率等性质也会影响荧光染料的荧光量子产率和荧光强度。
2.3 荧光基团自身的性质，如量子产率、消光系数和荧光寿命等，直接决定了其在特定条件下的荧光强度。量子产率高的荧光基团在相同条件下能够产生更强的荧光信号。
常用的荧光染料
1. FAM（羧基荧光素）
- 具有较高的荧光量子产率和良好的水溶性。
- 常用于核酸和蛋白质的标记，适用于荧光显微镜、流式细胞术和荧光定量PCR等技术。
- 缺点是光稳定性相对较差，容易发生光漂白。
2. FITC（异硫氰酸荧光素）
- 广泛应用于免疫荧光检测和细胞标记实验。
- 其激发波长在495纳米左右，发射波长在520纳米左右，与常见的荧光显微镜光源匹配良好。
- 但FITC对pH值较为敏感，在酸性条件下荧光强度会降低。
3. TAMRA（四甲基罗丹明）
- 常用于多重荧光标记实验，因其发射波长较长（约580纳米），可以与短波长的荧光染料（如FAM、FITC）区分开来，实现多色检测。
- 然而，TAMRA的荧光量子产率相对较低，需要较高的浓度才能获得较强的荧光信号。
4. Cyanine dyes（菁染料）
- 如Cy3、Cy5等，具有较高的消光系数和荧光量子产率。
- 其发射波长可以覆盖从可见光到近红外区域，适用于高灵敏度的检测和成像。
- 菁染料对环境的极性较为敏感，在不同的溶剂中可能会表现出不同的荧光特性。
5. ATTO dyes
- 具有出色的光稳定性和抗漂白性，适用于长时间的荧光观测和超分辨成像。
- 缺点是价格相对较高，限制了其大规模应用。
表1. 荧光染料
| 荧光团 | 激发波长 | 发射波长 |
| Trp (Tryptophan) |
280 nm | 360 nm |
| Mca ((7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl) |
325 nm | 392 nm |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
320 nm | 420 nm |
| N-Me-Abz (N-Methyl-anthraniloyl) |
340-360 nm | 440-450 nm |
| DMACA (7-Dimethylaminocoumarin-4-acetate) |
350 nm | 465 nm |
| EDANS (5-[(2-Aminoethyl)amino]naphthalene-1-sulfonic acid) |
340 nm | 490 nm |
| Cyanine Cy2 | 492 nm | 510 nm |
| FITC (Fluorescein isothiocyanate) |
490 nm | 520 nm |
|
Lucifer Yellow (6-Amino-2,3-dihydro-1,3-dioxo-2-hydrazinocarbonylamino- 1H-benz[d,e]isoquinoline-5,8-disulfonic acid) |
430 nm | 520 nm |
| Alexa 488 dye | 490 nm | 525 nm |
| Dansyl (5-(Dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl) |
342 nm | 562 nm |
| Cyanine Cy3 | 550 nm | 570 nm |
| Alexa Fluor 555 dye | 555 nm | 580 nm |
| Rhodamine B | 570 nm | 590 nm |
| Abberior Star635 | 635 nm | 655 nm |
| Cyanine Cy5 | 650 nm | 670 nm |
| Silicon-Rhodamine (SiR) | 652 nm | 674 nm |
波长与颜色的对应关系
荧光多肽的应用
1. 生物分子检测
1.1蛋白酶活性检测
- 蛋白酶在生物体内参与众多生理和病理过程，精确检测其活性对于理解这些过程至关重要。FRET（荧光共振能量转移）技术是一种常用的方法。以含有FRET对（如Abz / Dnp、EDANS / Dabcyl）的多肽底物为例，当蛋白酶作用于特定的肽键时，会导致荧光团和淬灭剂分离，从而产生荧光信号的增强。通过监测荧光强度的变化，可以定量测定蛋白酶的活性。关于FRET，下文有详细介绍。
- 除了FRET技术，基于荧光多肽的荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）和荧光相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS）等技术也被广泛应用于蛋白酶活性的检测。
1.2蛋白质 - 蛋白质相互作用研究
- 利用荧光多肽标记其中一个蛋白质，然后与另一个蛋白质相互作用。通过荧光共振能量转移、荧光偏振变化或荧光强度的变化，可以实时监测它们之间的结合和解离过程。例如，使用荧光标记的抗体与抗原结合，通过检测荧光信号的变化来确定结合的亲和力和动力学参数。
- 基于荧光多肽的双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）技术也是研究蛋白质相互作用的有力工具。将荧光蛋白分成两个不发荧光的片段，分别与两个相互作用的蛋白质融合。当蛋白质相互结合时，荧光蛋白片段重新组装形成完整的具有荧光活性的结构，从而产生荧光信号。
2. 细胞成像
2.1细胞内蛋白质定位和运动追踪
- 利用荧光多肽特异性地标记细胞内的蛋白质，如细胞骨架蛋白（肌动蛋白、微管蛋白）、膜蛋白或核蛋白等，可以在荧光显微镜下清晰地观察它们在细胞内的分布和动态变化。例如，使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的微管蛋白，可以实时观察细胞分裂过程中微管的形成和重组。
- 结合超分辨荧光显微镜技术，如受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）显微镜和单分子定位显微镜（Single - Molecule Localization Microscopy，SMLM），可以实现对细胞内蛋白质的超高分辨率成像，达到纳米级别的分辨率。
2.2细胞内信号通路研究
- 设计针对特定信号分子（如第二信使cAMP、钙离子等）的荧光多肽传感器，可以实时监测信号转导过程中的分子变化。例如，基于FRET原理构建的cAMP传感器，当cAMP浓度发生变化时，会导致传感器中荧光团之间的距离改变，从而引起荧光信号的比例变化，实现对cAMP浓度的实时定量检测。
- 利用荧光多肽标记信号通路中的关键蛋白质，如激酶、磷酸酶等，观察它们在细胞内的激活、转位和相互作用，有助于深入理解信号通路的调控机制。
3. 药物研发
3.1药物筛选
- 构建荧光多肽库，模拟药物靶点的结构和功能，与潜在的药物分子进行相互作用筛选。通过检测荧光信号的变化，可以快速筛选出与靶点结合的活性化合物。例如，针对受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase，RTK）设计的荧光多肽抑制剂库，可以用于筛选具有抗肿瘤活性的小分子药物。
- 基于荧光偏振的药物筛选技术，可以区分结合态和游离态的荧光多肽，从而定量测定药物分子与靶点的结合亲和力。
3.2药物输送和释放监测
- 将药物与荧光多肽偶联，不仅可以提高药物的靶向性，还能够通过荧光信号监测药物在体内的释放和分布情况。例如，使用具有肿瘤靶向性的多肽与抗癌药物连接，通过荧光成像可以实时跟踪药物在肿瘤组织中的积累和释放过程。
- 开发基于荧光多肽的智能药物载体，如pH响应型、氧化还原响应型或酶响应型载体，当载体到达特定的微环境（如肿瘤酸性环境、高氧化应激环境或特定酶的存在）时，会触发药物的释放，并通过荧光信号的变化进行监测。
荧光能量共振转移（FRET）
FRET是指在一定距离内，处于激发态的荧光团（供体）将能量非辐射地转移给邻近的荧光团（受体）分子的过程。FRET通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭）
FRET发生的条件包括：供体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠；供体和受体之间的距离在1 - 10纳米（1纳米=10埃，C-C单键长为1.5埃左右）范围内；供体和受体的跃迁偶极具有适当的相对取向。
能量转移效率取决于供体和受体光谱的重叠程度、它们的相对取向以及两者之间的距离。根据Förster理论，能量转移效率与距离的六次方成反比，即距离每增加一倍，能量转移效率降低至原来的1 / 64。
能量转移效率与距离之间的关系
常见的荧光团有Abz、N-Me-Abz、Dansyl、DMACA、EDANS、FITC、Lucifer Yellow、Mca、Trp等，淬灭剂有Dnp、EDDnp、4-nitro-phenylalanine、3-nitro-tyrosine、DABCYL、NBD等（如表2）。
表2. 供体/受体对
| Donor (Fluorophore) | Acceptor (Quencher) |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
Dnp (2,4-Dinitrophenyl) |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
EDDnp (N-(2,4-Dinitrophenyl)ethylenediamine) |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
4-Nitro-Phe (4-Nitro-phenylalanine) |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
3-Nitro-Tyr (3-Nitro-tyrosine) |
| Abz (2-Aminobenzoyl or Anthraniloyl) |
pNA (para-Nitroaniline) |
| N-Me-Abz (N-Methyl-anthraniloyl) |
Dnp (2,4-Dinitrophenyl) |
| Dansyl (5-(Dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl) |
4-Nitro-Phe (4-Nitro-phenylalanine) |
|
EDANS (5-[(2-Aminoethyl)amino]-naphthalene-1-sulfonic acid) |
DABCYL (4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoyl) |
| DMACA (7-Dimethylaminocoumarin-4-acetate) |
NBD (7-Nitro-benzo[2,1,3]oxadiazol-4-yl) |
| FITC (Fluorescein isothiocyanate) |
Dnp (2,4-Dinitrophenyl) |
|
Lucifer Yellow (6-Amino-2,3-dihydro-1,3-dioxo-2-hydrazinocarbonylamino- 1H-benz[d,e]isoquinoline-5,8-disulfonic acid) |
Dabsyl (4-(4-Dimethylaminophenylazo)- benzenesulfonyl) |
| Mca ((7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl) |
Dnp (2,4-Dinitrophenyl) |
| Trp (Tryptophan) |
Dnp (2,4-Dinitrophenyl) |
| Trp (Tryptophan) |
4-Nitro-Z (4-Nitro-benzyloxycarbonyl) |
| FAM | Dabcyl |
| TAMRA | BHQ3 |
总之，荧光多肽作为一种强大而富有潜力的研究工具，正不断推动着生物化学、生物技术和生物医学领域的发展。对于科研人员来说，深入研究和创新应用荧光多肽，将为揭示生命的奥秘、攻克重大疾病带来新的突破和希望。
Souce: 纽普生物 2024-08-11