轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿及多种幼畜急性腹泻的一个重要病原体。仔猪轮状病毒性腹泻是由轮状病毒引起的一种以厌食、呕吐、腹泻、脱水为特征的 传染病,导致仔猪死亡率升高或生长缓慢,给养猪业带来巨大经济损失。轮状病毒属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,可分为A~G 7个群,感染幼畜的轮状病毒多为A群。完整的病毒粒子表面光滑,无脂蛋白囊膜,含有完整外壳的实心光滑型颗粒,65~80nm,实心颗粒具有传染性。病毒 体核心由11段不连续的双股RNA组成,编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。VP7蛋白由基因片段7、8或9编码,分子质量为37ku,由326个氨基酸 组成,占病毒蛋白总量的30%。VP7蛋白是病毒外壳的主要糖蛋白和主要中和抗原,决定病毒的G血清型,目前已知有15个G型。其在病毒感染宿主细胞的入 胞过程中起重要作用。在入胞过程中,病毒粒子由TLP成为DLP,需钙离子与VP7蛋白参与。Aoki等研究结果表明针对VP7的抗体,可覆盖VP7表面 的亚基,从而抑制了蛋白与钙离子的结合,使病毒无法脱衣壳,进而无法进入细胞。Aoki等、Doronin等研究结果表明,表达VP7重组蛋白的78— 312位氨基酸可刺激机体产生保护性中和抗体。故本研究进行了A群G11血清型猪轮状病毒VP7重组蛋白51—312位氨基酸的原核表达,以期通过抗体制备技术得到具有中和活性的VP7单克隆抗体。
1 材料与方法
1.1 材料 表达载体pGEX-6P-1、SP2/0骨髓瘤细胞、含有VP7全长基因质粒、G5型PoRVGST-VP7重组蛋白均由哈尔滨兽医研究所猪病毒性腹泻课 题组保存;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生物技术公司;单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自郑州某生物工程有限公司。6周龄BALB/c小鼠购自哈尔滨兽 医研究所实验动物中心。
1.2 引物设计与合成 试验选取51-312位氨基酸,共262个氨基酸。据GenBank中登录的序列设计并合成1对表达引物。引物序列为:上游引物:5'- CGCGGATCCCAAAACTACGGAATAAATTT-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGCTTGGACATAACTTGTACAA- 3'。
1.3 pGEX-VP7重组表达载体的构建 以含VP7全长基因质粒为载体,进行VP7基因的截短克隆,然后进行BanHⅠ和XhoⅠ双酶切,胶回收酶切产物,与用相同酶酶切的pGEX-6P-1连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建pGEX-VP7重组载体。
1.4 G11型VP7蛋白的诱导表达及纯化 将pGEX-VP7转化大肠杆菌BL21菌,于LB中过夜培养,取3mL加入装有150mLLB的锥形瓶内,37℃摇菌培养至D600nm为 0.4~0.6,加入终浓度为1.0mmol/mLIPTG进行诱导表达,5~6h后收集菌体超声破碎,收集上清和沉淀,然后进行SDS-PAGE电泳, 检测表达产物,同时同样方法表达pGEX-6P-1空载体,作为空载体对照。参考高慎阳等的介绍,采用切胶法纯化表达蛋白。
1.5 单克隆抗体制备 小鼠免疫切胶纯化的蛋白,按50μg/只皮下注射免疫BALB/c小鼠。间隔2周后再次免疫,3次免疫之后,断尾采血,用间接ELISA检测小鼠抗体水平。细胞融合前3d进行加强免疫。
1.6 间接ELISA检测 将重组的G11型GST-VP7蛋白包被ELISA96孔板,用含5%脱脂乳的PBS,37℃封闭2h;PBST清洗3次,加入待检样品,并设阴性对 照,37℃温育1h;PBST清洗3次,加入HRP标记的羊抗鼠二抗,37℃温育45min;PBST清洗3次,加入TMB显色液,37℃温育 15min;加入2mol/L硫酸终止液;酶标仪测D450nm值。
1.7 细胞融合及阳性克隆筛选 融合前3d复苏SP2/0细胞,取加强免疫后的小鼠脾脏,制备脾细胞,用PEG1450促进脾细胞与SP2/0细胞融合,利用HAT培养液培养于96孔 板,37℃、5%CO2培养箱中培养。采用有限稀释法进行3次亚克隆。用1.5中的间接ELISA进行阳性克隆筛选,利用GST标签蛋白包被 ELISA96孔板,可筛掉针对GST标签的抗体。
1.8 抗体亚型的鉴定 参照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行抗体亚型的鉴定。
1.9 Westernblotting鉴定 用G11型重组蛋白GST-VP7、pGEX-6P-1空载体诱导表达的GST标签蛋白、超离后的全病毒蛋白对杂交瘤细胞培养上清进行 Westernblotting鉴定;并用G5型、G11型GST-VP7蛋白作为抗原,杂交瘤细胞培养上清作为一抗进行Westernblotting 鉴定。
1.10 中和试验 接种MA104细胞于96孔板中,37℃、5%CO2细胞培养箱培养至细胞铺满80%。取50μL2倍梯度稀释的杂交瘤细胞培养上清与等体积 10TCID50 PoRV混合,37℃孵育1.5h;弃细胞上清,将上述病毒血清混合物一式6份加入到96孔板MA104细胞中,同时设未经抗体处理的病毒直接感染细胞组 和未经任何处理的正常细胞对照组;加入100μL不含血清的病毒生长液,置37℃、5%CO2培养箱中培养48h;弃培养液上清,每孔加入含 5mg/mLMTT的PBS 50μL,继续培养4h;弃MTT上清,PBS洗3次,每孔加150μLDMSO,振荡10min,使结晶物充分融解;酶标仪测D490nm值。细胞存活 率计算公式为:细胞存活率=×100%。
1.11 间接免疫荧光鉴定 将PoRV接种MA104细胞,培养48h后以阳性杂交瘤细胞培养上清为一抗,以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗进行间接免疫荧光鉴定(张志榜等,2010)。
1.12 抗体稳定性试验 将阳性杂交瘤细胞连续传代20次,取第10、20代培养上清,进行ELISA检测,测定其抗体效价。
1.13 抗原表位预测 利用在线软件IEDB Analy-sis Resource对G5、G11型PoRV的VP7蛋白进行抗原表位预测。
2 结果与分析
2.1 蛋白诱导表达 VP7蛋白分子质量约30ku,GST标签约26.84ku,预期结果为57ku,经SDS-PAGE分析,结果显示,pGEX-VP7重组质粒在57ku处有目的条带,pGEX-6P-1空载体在约27ku处有目的条带,与预期结果相符。
2.2 杂交瘤细胞株的筛选及抗体亚型鉴定 经筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,命名为4B4。抗体亚类鉴定结果显示4B4为IgG2b型。用TGEV、PEDV、PoRV作为抗原包被96孔板进行ELISA检测,结果表明4B4具有PoRV特异性。
2.3 Westernblotting结果 本试验获得的4B4杂交瘤细胞培养上清与G11型GST-VP7蛋白呈阳性,与GST标签蛋白呈阴性,与全病毒的天然VP7蛋白在37ku处呈阳性。其对G11、G5型重组GST-VP7蛋白均有反应,对标签蛋白呈阴性反应。
2.4 中和试验结果 4B4杂交瘤细胞培养上清处理组细胞存活率为:0.998/1.182×100%=84.4%;病毒处理组细胞存活率为:0.402/1.182×100%=34.0%。
2.5 IFA检测结果 以获得的4B4阳性杂交瘤细胞培养上清对接种PoRV的MA104细胞和未接种PoRV的MA104细胞进行IFA试验,结果表明,接种PoRV的细胞培养物中出现绿色荧光,未接种PoRV的细胞培养物则未见荧光出现。
2.6 抗体稳定性 杂交瘤细胞连续传代20次,ELISA检测结果显示,10、20代细胞培养上清抗体效价一致,表明制备的4B4单克隆抗体稳定性良好。2.7共同表位区域 分析由图5可知,G5、G11血清型PoRVVP7蛋白氨基酸序列同源性为89.31%,且表位区存在着相同或相似区域,为寻找一个共同表位的抗体提供了 理论依据。
3 讨论
RV有2个主要的抗原蛋白,二者均能介导中和抗体的产生。VP4为血凝素抗原,值得注意的是并不是所有的RV都有血凝素。由于VP7比VP4具有更 强的抗原性和免疫原性,所以本试验采用VP7蛋白做抗原。原核表达完整VP7蛋白有一定的困难,由在线软件TMHMM Serverv.2.0分析VP7蛋白前50个氨基酸为信号肽,不能诱导产生中和抗体。刘勇尝试多种原核表达载体全长表达VP7蛋白,均未成功。本试验也 曾尝试了BL21、BL21、TOP10、Trsetta、Rosetta菌株及pGEX-6P-1、pET-30a、pET-28a、pET-32a、 pET-40b载体,进行交叉试验表达VP7全长基因,均未成功。可能原因是这些VP7中存在潜在的大肠杆菌启动子序列,从而影响了VP7基因的稳定和表 达。另外,VP7蛋白对宿主有潜在的毒性。故本研究采用截短表达的VP7蛋白(51-312位氨基酸)作为抗原。
MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在 细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围 内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验及肿瘤放射敏感性测定等。刘 钊等研究结果表明MTT法较光镜CPE法省时省力,且客观、准确、高效、特异、敏感,是一种可广泛应用的试验方法。MTT法中和试验结果表明,本试验所得 到的4B4单克隆抗体对病毒具有抑制作用。抗体结合VP7蛋白,抑制病毒脱衣壳,从而不能进入宿主细胞,抑制其对宿主的感染。本试验中利用得到的4B4单 克隆抗体对2种不同G型PoRV的VP7抗原表位区蛋白做Westernblotting,结果显示4B4对G5和G11型PoRVVP7蛋白都有反应; 氨基酸序列比对结果显示G5和G11型PoRVVP7蛋白氨基酸序列的同源性为89.31%,且存在完全相同的表位区,如"TDEANK",也有相似区。 结果表明虽然血清型G的分型不一样,但抗原表位具有共同或相似区域,有待于进一步研究。本试验成功表达了VP7蛋白,最终获得了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞 株4B4,具有免疫特异性,为PoRV的诊断、检测等奠定了一定的基础。 （来源：期刊）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410271111.html
(by admin)
2014-10-27