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　　这是最早的敲除方法，也就是通过同源整合的方式定点将基因敲除的方法。

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　　原理：自杀质粒通常为R质粒的衍生质粒，常有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。

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　 　利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源 性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。在多数情况下，利用自杀质粒，可随心所欲缺失大多数基因的任何部分。这种方法现在也还有人在使用， 通过同源的重组可以随心所欲地敲减掉基因或者插入基因，但是这并不是最佳的方法。

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RNA干扰

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　　后来随之出现的就是传说中的“siRNA”的方法，RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现的。即用小片段的RNA把RISC（RNA沉默复合体）来对基因进行沉默，在这个方法的基础上衍生出了“shRNA”和慢病毒敲除等等的方法。RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。但敲减效率也往往是RNAi的一个软肋。

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锌指核糖核酸酶（ZFN）技术

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　　然后，由于发现了锌指蛋白能特异性识别DNA， 锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc- fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。利用这种特性在串连的锌指核酸酶尾部加上了剪切酶，于是就产生 了ZFN这种技术。自此，蛋白对DNA序列的识别就引入了基因敲减这个技术的行列。但据报道，ZNF的脱靶效率会比较高，所以这项技术的完善也还有很长的路要走。

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TALEN (transcription activator-like (TAL) effectornucleases)技术。

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　　ZFN技术虽然高大上，但是并不是那么稳定，于是根据这个思路，研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。研 究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序 列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。就产生了TALEN (transcriptionactivator-like (TAL) effector nucleases)技术。

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CRISPR技术

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　 　在蛋白识别DNA这种理论的基础上，最新的技术就是CRISPR技术。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，第一次是在1987年在大肠杆菌中有报道，到2000年时，有人证实了目前为止，已有 40%已测序的细菌和90%已测序的古细菌中有报道。CRISPR含有一个与噬菌体和质粒同源的短的重复序列，通过对外来同源的DNA作用对噬菌体有抗性，影响质粒的连接，是原核生物的免疫系统一部分。

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　 　CRISPR sequences是一个高度多变的DNA序列，常包含一个550bp的leader 序列和一系列重复单位（repeat-spacer units）。重复序列长度在24-48bp，他们通常会形成二重对称，因此会形成如发夹结构的二级结构，但不是回文结构，重复次数最高可达250 次。

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　 　CRISPR/Cas系统中crRNA与tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即单向导RNA（Singleguide RNA,sgRNA）。sgRNA可以介导Cas9蛋白在特定序列处进行切割，形成DNA双链断裂（Double-Stranded Break, DSB），完成基因定向编辑等的各类操作。

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　 　近年来TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三大基因定点修饰技术已经广泛应用于生命科学与医学的各个方面，包括但不局限于转基因动植物模型的构 建、基因治疗及转基因育种等。虽然TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三种技术在技术细节上有着各自独一无二的特色，但它们在各类应用中的基本模式 却是相似的。相信将来，基因的敲减技术，还会有突飞猛进的进步!
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410281119.html

(by admin)

2014-10-28