?????? CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA 介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒。CRISPR/Cas 系统可分为三种类型，其中类型Ⅱ CRISPR/Cas 系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。在类型Ⅱ CRISPR/Cas 系统中，CRISPR 能够转录产生前体crRNA （Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA 经过Cas9-tracrRNA 复合物加工后产生成熟的crRNA （CRISPR RNA），crRNA 的5'端区域能够与靶位点互补配对， 而其3'端能够与tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9 蛋白形成复合物，从而引导Cas9 蛋白结合于靶位点进行特异性地切割。CRISPR/Cas 系统与其他外源核酸防御系统（如限制修饰系统）最重要的区别在：CRISPR/Cas 系统具有记忆性， 细菌会记忆首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵时，特异性的识别并切割这些外源核酸酶使其降解，保护自身遗传物质的完整准确。特异的Cas 蛋白会识别外源性的遗传物质中具有原型间隔序列毗邻区（protospacer adjacent motifs，PAM）的DNA 片段，通过Cas 蛋白将PAM5'端的DNA（即原型间隔序列）加工成短的DNA 片段，插入到其CRISPR序列的重复序列之间，最终使得细菌通过spacer 序列识别并且随后靶向这些外来原件进行切除。类型Ⅱ CRISPR/Cas 系统组成最为简单，只需要Cas9 蛋白、tracrRNA、crRNA、RNase Ⅲ四种成分即可发挥作用。在这一系统中，Cas9 蛋白在crRNA 的加工以及对外源DNA 的特异性切割中都发挥着重要的作用。因此本综述也主要介绍针对类型ⅡCRISPR/Cas 改造而来的相关技术。
1 CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
?????? CRISPR/Cas 系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA 序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA 序列使得Cas9 系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA 序列上，最终介导Cas9 蛋白特异性的切割该杂交区域。与crRNA 互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA 存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM 序列对于Cas9 系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义， 其使得双链RNA 复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。在Cas9 系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA 首先与crRNA 形成crRNA：tracrRNA 复合体，Cas9 蛋白识别并与crRNA：tracrRNA 复合体结合， 在crRNA 的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据cr-RNA：tracrRNA 复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA 具备crRNA：tracrRNA 复合体的功能，能够被Cas9 蛋白识别并引导Cas9 蛋白结合于靶位点。上述Cas9 所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9 作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生双链DNA 断裂（Double strand break，DSB） 后， 细胞可以通过两种方式对DNA 进行修复， 非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能。而同源重组往往通过供体DNA 与基因组DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因。由于sgRNA 对靶序列识别的长度只有20 个碱基，且Cas9 蛋白对sgRNA 5'端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA 技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9 蛋白（Cas9 D10A）被构建出来。这种突变型的Cas9 核酸内切酶是将Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）。这样需要有结合于两条互补的DNA 链上相邻位置的一对sgRNA 同时引导Cas9 D10A 识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA 技术的特异性。
2 利用Cas9 系统在转录水平对基因表达的调节
?????? Cas9-sgRNA 作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9， 但是dCas9 仍保留了与靶位点特异性结合的能力， 这样将dCas9-sgRNA 作为与DNA 特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值。dCas9-sgRNA 结合与DNA 上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9 的C 端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA 具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9 的C 端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA 成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤。
3 利用Cas9 系统对目标RNA 序列进行操纵
?????? 最近， 相关研究证明了病原体Francisella novicida 基因组中编码的Cas9 核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用。该文章报道了通过tracrRNA 和一种新型的小RNA （small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA 相结合， 从而进一步发生反应的过程。随后， 这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA 复合结构的各组分之间互作导致了mRNA 稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9 或可能其他的Cas9 系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9 系统优先靶向RNA 或DNA 的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9 系统的一个个例， 具有较强的结构特异性和序列需求性。
?????? FnCas9 系统靶向特定的RNA 序列原理做出第一种推测是， FnCas9 系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA 结合的。相反，在FnCas9 系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA 的过程中发挥了重要的作用。FnCas9 系统可能在tracrRNA 和mRNA 中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解。另一种推测是介导RNA 和靶向RNA 之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F. novicida 中出现，tracrRNA 上与mRNA 反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合， 从而形成tracr-RNA-mRNA 复合物。这项新的技术一经提出， 预示着FnCas9 将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA 等传统RNAi（small interferingRNA）技术成为一种新型的RNA 干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进行RNA 干扰。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA 的作用。当然，FnCas9 系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9 系统一种存在于Pyrococcus furiosus的CRISPR/Cas 蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA 底物。研究发现，与先前提到的FnCas9 相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA 序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9 系统的FnCas9 干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi 技术的进步。
4 展望及结语
??????? 到目前为止对CRISPR/Cas9 技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9 系统会被sgRNA 引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA 的二级结构、改变sgRNA 的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应。另外，PAM 区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道， 在对于Neisseria meningitidis 中的Cas9 系统（NmCas9）的PAM 序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9 系统的PAM 区域（5'-NNNNGATT-3'） 与Streptococcus thermophilus中的Cas9 系统的PAM 区域（5'-NNAGAAW-3'）比Streptococcus pyogenes Cas9 （5'-NGG-3'） 对PAM 区域配对的要求严格的多。
?????? 从最开始认识到CRISPR 作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代， 认识到CRISPR/Cas9 是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中。CRISPR/Cas9 系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9 系统和相应的靶向致病基因的sgRNA 载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN 和TALEN 等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9 核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9 系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410311131.html
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1 CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
?????? CRISPR/Cas 系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA 序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA 序列使得Cas9 系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA 序列上，最终介导Cas9 蛋白特异性的切割该杂交区域。与crRNA 互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA 存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM 序列对于Cas9 系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义， 其使得双链RNA 复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。在Cas9 系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA 首先与crRNA 形成crRNA：tracrRNA 复合体，Cas9 蛋白识别并与crRNA：tracrRNA 复合体结合， 在crRNA 的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据cr-RNA：tracrRNA 复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA 具备crRNA：tracrRNA 复合体的功能，能够被Cas9 蛋白识别并引导Cas9 蛋白结合于靶位点。上述Cas9 所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9 作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生双链DNA 断裂（Double strand break，DSB） 后， 细胞可以通过两种方式对DNA 进行修复， 非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能。而同源重组往往通过供体DNA 与基因组DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因。由于sgRNA 对靶序列识别的长度只有20 个碱基，且Cas9 蛋白对sgRNA 5'端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA 技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9 蛋白（Cas9 D10A）被构建出来。这种突变型的Cas9 核酸内切酶是将Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）。这样需要有结合于两条互补的DNA 链上相邻位置的一对sgRNA 同时引导Cas9 D10A 识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA 技术的特异性。
2 利用Cas9 系统在转录水平对基因表达的调节
?????? Cas9-sgRNA 作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9， 但是dCas9 仍保留了与靶位点特异性结合的能力， 这样将dCas9-sgRNA 作为与DNA 特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值。dCas9-sgRNA 结合与DNA 上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9 的C 端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA 具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9 的C 端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA 成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤。
3 利用Cas9 系统对目标RNA 序列进行操纵
?????? 最近， 相关研究证明了病原体Francisella novicida 基因组中编码的Cas9 核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用。该文章报道了通过tracrRNA 和一种新型的小RNA （small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA 相结合， 从而进一步发生反应的过程。随后， 这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA 复合结构的各组分之间互作导致了mRNA 稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9 或可能其他的Cas9 系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9 系统优先靶向RNA 或DNA 的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9 系统的一个个例， 具有较强的结构特异性和序列需求性。
?????? FnCas9 系统靶向特定的RNA 序列原理做出第一种推测是， FnCas9 系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA 结合的。相反，在FnCas9 系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA 的过程中发挥了重要的作用。FnCas9 系统可能在tracrRNA 和mRNA 中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解。另一种推测是介导RNA 和靶向RNA 之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F. novicida 中出现，tracrRNA 上与mRNA 反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合， 从而形成tracr-RNA-mRNA 复合物。这项新的技术一经提出， 预示着FnCas9 将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA 等传统RNAi（small interferingRNA）技术成为一种新型的RNA 干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进行RNA 干扰。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA 的作用。当然，FnCas9 系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9 系统一种存在于Pyrococcus furiosus的CRISPR/Cas 蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA 底物。研究发现，与先前提到的FnCas9 相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA 序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9 系统的FnCas9 干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi 技术的进步。
4 展望及结语
??????? 到目前为止对CRISPR/Cas9 技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9 系统会被sgRNA 引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA 的二级结构、改变sgRNA 的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应。另外，PAM 区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道， 在对于Neisseria meningitidis 中的Cas9 系统（NmCas9）的PAM 序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9 系统的PAM 区域（5'-NNNNGATT-3'） 与Streptococcus thermophilus中的Cas9 系统的PAM 区域（5'-NNAGAAW-3'）比Streptococcus pyogenes Cas9 （5'-NGG-3'） 对PAM 区域配对的要求严格的多。
?????? 从最开始认识到CRISPR 作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代， 认识到CRISPR/Cas9 是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中。CRISPR/Cas9 系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9 系统和相应的靶向致病基因的sgRNA 载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN 和TALEN 等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9 核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9 系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201410311131.html
(by admin)
2014-10-31