PCR、qRT-PCR最最初始，都离不开RNA的抽提，RNA质量的好坏，直接影响到后续的反转录及PCR等过程。很多时候，小伙伴们明明跟着Trizol步骤一步一步来的，谨小慎微，不敢懈怠，但就是RNA抽提不过关。其实Trizol抽提RNA是个细活儿，小伙伴们根据自身的实战经验，做一下优化很有必要~
Trizol标准抽提步骤（★是要注意的地方）：
1. 将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离。
★样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以12,000 rpm 离心10 min，移去漂浮的油脂，取上清。
2. 加入0.2 ml 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4°C离心10 min。
★如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2 min。
★样品会分成三层：上层水相，中间层和下层有机相。RNA 在上层水相中。
3. 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min。
★不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。
4. 12,000rpm 4°C 离心10 min，弃上清。
★离心前RNA 沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
5. 加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清。室温干燥5-10 min。
★ 75%乙醇用DEPC 处理过的水配制。
★通常1 ml Total RNA Extractor需用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。
★不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，不要吸沉淀。
★不要晾的过干，RNA 完全干燥后很难溶解，大约晾干5 min左右。
6. 加入30-50 μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70°C保存或用于后续试验。
★对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。
额外的小TIP~（第三步）：
很多刚开始学抽提的小伙伴吸取上层水相总是吸到中间层物质。老谈觉得，既然吸上层手容易抖，那不妨吸下层遗弃然后把剩余的再进行离心。这样多一步，离完心剩下的基本就是上层水相和中间层沉淀，再吸取想要的目标就能轻松改掉手抖啦～
Protocal 改善的地方~(哈哈，还是第三步)：
3.吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入2.5倍体积乙醇，1/10倍体积3M醋酸钠，以及糖原。混匀，-80°C放置30-60min。
★不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。
★加入糖原，使溶液中糖原的最终浓度达到50ng/μl。
★混匀后，-80°C放置30 -60min，适当增长孵育时间或者降低孵育温度将有助于小RNA的沉降。
★以取500μl上层水相为例，则需加入1250μl乙醇，50μl醋酸钠以及4.5μl糖原原液（原液浓度为：20mg/ml）。
（来源：解螺旋）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411211142.html
(by admin)
Trizol标准抽提步骤（★是要注意的地方）：
1. 将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离。
★样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以12,000 rpm 离心10 min，移去漂浮的油脂，取上清。
2. 加入0.2 ml 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4°C离心10 min。
★如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2 min。
★样品会分成三层：上层水相，中间层和下层有机相。RNA 在上层水相中。
3. 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min。
★不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。
4. 12,000rpm 4°C 离心10 min，弃上清。
★离心前RNA 沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
5. 加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清。室温干燥5-10 min。
★ 75%乙醇用DEPC 处理过的水配制。
★通常1 ml Total RNA Extractor需用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。
★不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，不要吸沉淀。
★不要晾的过干，RNA 完全干燥后很难溶解，大约晾干5 min左右。
6. 加入30-50 μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70°C保存或用于后续试验。
★对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。
额外的小TIP~（第三步）：
很多刚开始学抽提的小伙伴吸取上层水相总是吸到中间层物质。老谈觉得，既然吸上层手容易抖，那不妨吸下层遗弃然后把剩余的再进行离心。这样多一步，离完心剩下的基本就是上层水相和中间层沉淀，再吸取想要的目标就能轻松改掉手抖啦～
Protocal 改善的地方~(哈哈，还是第三步)：
3.吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入2.5倍体积乙醇，1/10倍体积3M醋酸钠，以及糖原。混匀，-80°C放置30-60min。
★不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。
★加入糖原，使溶液中糖原的最终浓度达到50ng/μl。
★混匀后，-80°C放置30 -60min，适当增长孵育时间或者降低孵育温度将有助于小RNA的沉降。
★以取500μl上层水相为例，则需加入1250μl乙醇，50μl醋酸钠以及4.5μl糖原原液（原液浓度为：20mg/ml）。
（来源：解螺旋）
原文链接: http:/www.novoprolabs.com/support/articles/201411211142.html
(by admin)
2014-11-21