单克隆抗体的腹水制备实验

1.  用20G或22G的注射针,小鼠腹膜内注射降植烷,每只鼠0.5 ~ 1 ml,1周后接种细胞。
2.  在175 cm 2 培养瓶中加完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液,进行杂交瘤细胞的培养,使细胞生长至对数期。
3.  将培养液转入50 ml 锥形离心管中,室温下500 g 离心5 min。
4.  细胞重悬于50 ml 无菌的PBS或HBSS(不含FBS)中洗涤。然后室温下500 g 离心5 min,弃上清。重复2次,然后细胞重悬于5 ml 的PBS或HBSS中。
5.   计数细胞,通过台盼蓝染色法确定细胞活力。
6.  用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5×10 2 细胞/ml。
7.  用一个10 ml 的无菌的带22G针头的注射器,对裸鼠进行腹膜内注射2 ml 细胞,等待腹水形成(1~2周)。

8.  收获腹水。

(1)一只手抓住并固定小鼠,使其腹部皮肤绷紧。

(2)另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔1~2 cm 深。

(3)进针部位为左下腹或右下腹,以避免刺入鼠上腹部的重要器官,以及腹中线处的主要大血管。

(4)令腹水滴入一只无菌的15 ml 聚丙烯锥形离心管中。

9.  于室温下,1 500 g 离心腹水10 min,收集上清,弃沉淀,将腹水存放于4℃,直到收集腹水的工作完成(在1周内)。
10.  再次收获腹水前,让小鼠再次积累腹水(2~3天),具体操作同步骤8,腹水的加工处理操作同步骤9。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集,或者小鼠健康状况不佳。此时,可处死小鼠

11.  把在几天内收集到的腹水汇集到一起,于56℃水浴45 min 进行热处理,如果凝块形成,可参照步骤9中方法去除之,然后再离心。

12.  采用适当的方法检测腹水中的MAb的滴度。
13.  按大于1:10的比例稀释MAb,并进行滤过除菌,滤膜孔径为0.45 μm,分装并冻存于-70℃,避免反复冻融,可冻存数年之久。

2014-12-12