1. 重复基本方案中的步骤1~5。
2. 在高质量的低融点胶中分离久DNA（0.7%，TAE缓冲液），切下体积尽可能小的所需DNA条带（20~50 μl ）至小离心管中。
3. 在70℃融化低融点胶10 min 以上，每个连接反应在不同的试管中进行。
4. 在的体积中混合含适当DNA的凝胶块（需要时用水补足）37℃放置数分钟。
5. 加入11 μl 冰冷的含2×缓冲液、ATP和T4 DNA连接酶的混合物，并于15℃温育1 ~48 h。
6. 在73℃重新融化胶5~10 min 取5 μl 连接产物加于200 μl 感受态大肠杆菌，见基本方案中的步骤8。
7. 重复基本方案中的步骤9。
7. 重复基本方案中的步骤9。