用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残留在未被破坏细胞内的放射性核素放射活性，即可计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。常用的放射性核素有51Cr、3H-Dr、125I-UdR等。本实验采用51Cr释放法检测人NK细胞活性。
一、材料准备
1. 靶细胞制备
（1）取传代培养24~48小时对数生长期的K562，用RPMI-1640培养液洗涤2次，用10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度4×10 6 /ml。
（2）0.5 ml K562细胞悬液加3.7~7.4MBq（100~200uCi） 51 Cr，5%CO 2 ，37度孵育90分钟，每个15分钟振摇一次。
（3）RPMI-1640培养液洗涤3次，洗去未标记的游离 51 Cr。
（4）10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10 5 /ml，同时检测细胞的 51 Cr标记率，一般要求标记率＞0.1 cpm/cell。
（5）如暂时不用，可放置4度保存12小时。
2. 效应细胞制备：淋巴细胞分层液分离人PBMC，10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10
7
/ml
二、操作步骤
1. 加样：取上述效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T=100：1）加入96孔培养板内，3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml靶细胞+0.1 ml 2%SDS）。37度，5%CO
2
孵育4小时。
2. 测定：1000 r/min 离心培养板5分钟，用微量移液器吸出各孔上清0.1 ml，加于计数管内，用γ计数仪测定放射活性cpm值。
3. 计算：根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞毒活性
（1）51 Cr自然释放率（%）=（自然释放孔cpm值）/（最大释放孔cpm值）×100%
（2）NK细胞毒活性（%）=（试验孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）/（最大释放对照孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）×100%
注意事项
1. 靶细胞的质量非常重要，用台盼蓝拒染色法检测K562靶细胞的存活率应＞95%。标记后的自然释放率应＜15%。
2. 效靶细胞比率一般选择50~100：1，其自然杀伤率不再呈对数增加，标本用量过大。
3. 由于放射性核素具有毒性，标记的靶细胞不宜放置过久，与效应细胞作用时间也不宜过长，因随时间的延长死细胞增多，自然释放率也随之增高。
2014-12-12