IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时,IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量,推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性,可了解单核-巨噬细胞等的功能。
1. 小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导
(1)常规收集小鼠腹腔巨噬细胞,10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×10 6 /ml,接种于24孔培养板,0.5 ml/well。
(2)每孔加20 ug/ml LPS 0.15 ml,37度,5%CO2孵育36~48小时。
(3)此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1,收集培养上清,12000 r/min 离心15分钟,将上清移入新的1.5 ml 试管中,-20℃冻存。
2. IL-1的生物学活性测定
(1)胸腺细胞的制备:颈椎脱位处死小鼠,无菌取胸腺至于平皿中,加入5 ml 10%FCS-IMDM培养液,200目不锈钢网制成单个细胞悬液;1500 r/min 离心10分钟,再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后,重悬于10%FCS-IMDM培养液中,调细胞浓度为1.0×10 7 /ml。
(2)加样:取胸腺细胞加入96孔细胞培养板,0.1 ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品,50 ul/well,实验孔再加入50 ul ConA(终浓度0.625 ug/ml),同时设培养液对照孔(0.1 m l细胞+0.1 ml 培养液)、ConA对照(0.1 ml 细胞+50 ul 培养液+50 ul ConA),均设3复孔。37度,5%CO
2
孵育36~60小时。
(3)
3
H掺入:每孔加1.85×10
10
uBq/20 ul(0.5 uCi/20 ul)
3
H-TdR,继续培养8小时。
(4)测定:多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上,用β液体闪烁仪测定
3
H-TdR
(5)掺入量(cpm)以净cpm值(实验孔-ConA对照孔cpm值)为纵坐标,对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标,在半对数图纸上绘制出标准曲线,再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。
注意事项
1. 吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时,必须离心,以除去细胞及细胞破碎成分。
2. ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量,即选择能够激活胸腺细胞,又不引起明显增殖的量,如果ConA过量,则不能有效反应IL-1的刺激活性。