IL-8生物学活性检测实验

一、IL-8的诱生

1.  常规分离PBMC,洗涤后,调细胞浓度为5×10 6 /ml。


2.  将细胞接种于24孔细胞培养板,每孔0.5 ml。

3.  加诱生剂LPS(20 ug/ml),每孔0.5 ml,37度,5%CO 2 孵育48 h。

4.  离心收集细胞培养上清液,用HCl溶液调为酸性(pH4.0),经SephadxG-75柱分离,收集活性组分即为待测的IL-8粗品。

二、IL-8的生物活性检测

1.  琼脂板的制备;取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液(2×浓缩),混合,取3 ml 加到洁净的载玻片上,铺成薄层,室温凝固后,放4℃,进一步凝固30~60分钟,红打孔器打孔。

2.  中性粒细胞制备:常规分离人外周血中性粒细胞。

3.  加样:取10 ul 中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔,分别取10 ul 待检样品及阳性对照品加入样品孔,取10 ul DMEM培养液加入对照孔;将玻片置于湿盒内,37℃温育2小时。

4.  染色:用甲醇溶液固定30分钟,用瑞氏染液染片并干燥。

5.  检测:显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离(趋化游走距离)及向阳性对照孔的游走距离(自发游走距离),趋化活性以趋化指数表示。

6.  趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离
注意事项
为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应,最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。

2014-12-12