1.  将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒，由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入玻片盒中（每边放6片），或故湿盒中（载玻片勿相互接触）。

2.  待载玻片达室湿且未干时，铺加PBS于切片上（勿溢出玻片）。

3.  室温下在含0.25%过氧化氢的PBS中温育30 min，以PBS洗3次。

4.  稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每一载玻片上加40~50 μl 抗体，应能盖住切片）。

5.  用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1 h。

6.  以PBS冼玻片3次（5 min/次），从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。

7.  载玻片上加特异性桥连二抗，室温温育1 h。以PBS洗3遍。

8.  加PAP复合物，室温放1 h。以PBS洗3遍。

9.  室温下DAB底物液显色2~5 min。（显色时间长短依实验经验而定）。

10.  冼片并固片，置玻片盒中在暗处存放（不必冻存）。