1. 用生物素酰化探针与切片进行杂交、洗涤，进行第一轮杂交信号检测。
2. 如切片已承加盖玻片并密封。可用一针头或解剖刀片划开密封的指甲油，移去盖玻片， 并除去载玻片上指甲油。将玻片浸于0.1%Triton X-100/4×SSC 15 min，并轻摇。盛液的Coplin 广口瓶外裹以铝箔以避光，如盖玻片不易松动，应小心去除，重复洗涤2次。
3. 吸去载玻片上残余溶液，在载玻片上加50 μl 的1~3 μg/ml 生物素酰化抗亲和素抗体，盖以22 mm 2 大小的Parafilm 膜，置加湿盒中，湿盒外裹以铝箔，放37℃温育30 min。
4. 取掉Parafilm 膜，在0.1%Triton X-100/4×SSC中轻摇洗涤15 min。
5. 吸去玻片上残液，加50 μl 生物素信号放大溶液，盖以Parafilm 膜。放在裹以铝箔的加湿盒中，于37℃温育30 min。
6. 移去Parafilm 膜，并以0.1%Triton X-100/4×SSC洗涤15 min。然后以4×SSC洗涤15 min，洗涤时应轻轻摇动。
7. 复染，加盖玻片，并于显微镜下现察（见“”基本方案，步骤9~12）。