酵母细胞破碎实验-玻璃珠破碎法

1.  培养并收集酵母菌细胞,在酵母消解酶缓冲液重悬菌体沉淀之前,测定压紧细胞的体积,以下所有步骤均在4℃进行。

2.  用1体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。

3.  用2体积的玻璃珠破菌缓沖液与细胞混合,加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。
4a.  当压紧的细胞休积<10 ml,将细胞悬液转移至合适大小的带螺口的离心管中(悬液占离心管≤60%~70%的容积),于4℃以最大速度下振荡30~60 s,将管置于冰上放置1~2 min,重复3~5次,在显微镜下检査破细胞的程度,继续步骤5。

4b.  当压紧的细胞体积>10 ml,将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中(建议用导热性能好的不锈钢材料)并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘,但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖,确保将容器中所有空气排尽(排除空气以防止起泡和蛋白质变性这一点非常重要),高速搅拌60 s,冰上放置1~2 min,重复3~5次。

5.  沉淀玻璃珠,轻轻倒出上清,加入2~4体积的玻璃珠破菌缓冲液,颠倒管5~10次,待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清,合并上清液。

6.  合并的上清液于4℃,12 000 g 离心60 min,收集上清即为抽提液。长期贮存时,将其分成小份于液氮中快速冷冻,-80℃贮存。

2014-12-12