1. 制备病毒上清的系列稀释液,该病毒上清获得自在无血清完全培养液中转染 pAC360β-gal DNA的细胞。在含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物下病毒形成蚀斑。
2. 当蚀斑形成后,用灭菌巴斯德吸管挑取一个分离较好的蓝色蚀斑,并将琼脂糖块移入 一支含有1 ml 无血清完全培养液的无菌试管中。在旋涡混合器上剧烈篱荡,并用无血清完全培养液制备10
-1
、10
-2
和10
-3
的系列稀释液。
3. 用含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物蚀斑测定病毒(有助于发现重组子),重复蚀斑试验,直到获得纯的重组病毒贮液。
4. 用无菌吸管挑取一个纯的重组蚀斑,将琼脂糖块移入一含2.5×10
6
Sf9细胞和5 ml 完全培养液(含10%胎牛血清)的25 cm
2
培养瓶中。于27℃温育4~5天直到大多数细胞被感染。
5. 确定病毒滴度(应在5×10
7
~1×10
8
pfu/ml之间)。
6. 加入1 ml 该毒种贮液于一支1.5 ml 螺口冻存管中,于-80℃可长期保存,于4℃保存剩余的液体(标记为初代毒种液)。从初代毒种液中生产大批病毒贮液并滴定之。