1. 在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入
（1）10×碱性磷酸酶缓冲液 10 μl
（2）碱性磷酸酶（0.01 u/pmol ends） 1-2 ul
（3）ddH 2 O到100 ul
（4）对于5‘突出则37℃下温浴30分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴30分钟。
（5）对于平末端或3’突出末端，则37℃下温浴15分钟，56℃下温浴15分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴15分钟。56℃下温浴15分钟。
2. 温浴结束后加入EDTA（pH8.0）至终浓度分别为10 mM，65℃加热20 min，以灭活碱性磷酸酶。
3. 用酚、氯仿各抽提一次。
4. 加入1/2体积NH 4 AC，充分混匀，再加入2体积的乙醇，-20℃放置2 hr（或-70℃30分钟），12 000 g 离心10分钟，沉淀DNA。
5. 冷70%乙醇洗沉淀一次。
6. TE溶解（终浓度为100 μg/μl），-20℃保存。