DNA片段的回收实验-树脂回收法

本方法特别适合于PCR片段的回收,具有纯度高、操作简洁等特点,经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来,成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。
一、从琼脂糖介质中纯化DNA片断

1.  用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE。


2.  在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克)

3.  如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B步骤进行。

A.  将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,加入1毫升纯化用树脂,然后将其置于65℃水浴保温5分钟,或保温至琼脂完全溶解。

B.   将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,然后将其置于70℃水浴保温至琼脂完全溶解,然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中,将其混合20秒,但不要振动。

4.  为每一个待回收片断准备好一个微量柱。 在每个柱的开口处,联上一针筒,然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

5.  在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物,打开真空装置,将树脂与DNA的混合物抽到微量柱中,断开真空装置与柱的连接。

6.  洗柱,加入2毫升80%的异丙醇,打开真空装置,使这些洗柱液完全流经微量柱。

7.  继续真空30秒以干燥树脂,注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空,移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10 000 g 离心2分钟,以彻底除去残存的异丙醇。

8.   将微量柱,再转移至一新的1。5毫升微量离心管中,加入50微升水或TE缓冲液,静置1分钟(在头30秒,DNA仍将吸附于柱上), 10 000 g 离心20秒,以洗脱DNA片断,所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。

二、尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断

1.  从变形胶上切下待回收片断,将其放如一微量离心管中。

2.  加入100微升TE缓冲液,37℃保温30分钟以上。

3.  将上清液吸入一新管中,加入1毫升树脂,振荡20秒以混匀树脂与清液。
注意事项
1.  对于>3 Kb 的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3 Kb 时,洗脱液温度应为65-80℃;待洗脱片断>20 Kb 时,洗脱液温度应达80℃。

2.  应用TAE缓冲液,而不应用含TBE的胶,因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物,这种复合物使胶难熔解。

3.  在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在25-37℃,温热10分钟,冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。

4.  在紫外光下观察切割条带时,操作要快,DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短,因UV会引起DNA变异。

2014-12-12