厌氧微生物的培养实验

焦性没食子酸与碱性溶液作用后,形成碱性没食子酸盐,在此反应过程中能吸收氧气而造成厌氧环境;牛肉渣内既含有不饱和脂肪酸能吸收氧,又含有谷胱甘肽(glutathione)能形成负氧化还原电位差;厌氧罐是采用某种方法除去其中的氧,例如将镁与氧化锌制成产氢气袋,放入罐中加水反应产生氢,钯或铂是催化剂,在常温下催化氢与氧化合成水,则可除去密封的厌氧罐中的氧。
1.  焦性没食子酸法

(1)大管套小管法在大试管中放入少许棉花和焦性没食子酸,焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100 ml 空气中的氧来估计,本实验用量约0.5 g。接种巴氏芽孢梭菌在小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面上,迅速滴入10%的NaOH于大试管中,使焦性没食子酸润湿,并立即放入除掉棉塞已接种菌的小试管斜面(小试管口朝上),塞上橡皮塞或拧上螺旋帽,置30℃培养。


(2)培养皿法取玻璃板一块或用培养皿盖,铺上一薄层灭菌脱脂棉,将1 g 焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板,待凝固稍干燥后,在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌,下一半划线接种荧光假单胞菌,并在皿底用记号笔作好标记。滴加10%NaOH溶液约2 ml 于焦性没食子酸上,切勿使溶液溢出棉花,立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上,必须将脱脂棉全部罩住,焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触,以溶化的石蜡凡士林液(即vaspar)密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置30℃温箱培养。

2.  疱肉培养基法

(1)取已除去筋膜、脂肪的牛肉500 g,切成小方块,置1000 ml 蒸馏水中,以小火煮1小时,用纱布过滤,挤干肉汁,将肉汁保留备用。再将肉渣用绞肉机绞碎,或用刀切碎,最好使其成细粒。

(2)将保留的肉汁加蒸馏水,使总体积为2000 ml,加入20 g蛋白陈,2 g葡萄糖,5 g NaCl和绞碎的肉渣。置烧瓶中摇均匀,加热使蛋白胨溶化。

(3)取上层溶液调整pH为8.0,在烧瓶壁上用记号笔标明瓶内液体高度,1.05 kg/cm 2 ,121.3℃灭菌15分钟后补足蒸发的水量,重新调整pH为8.0,再煮沸10~20分钟,补足水量,再调整pH为7.4。

(4)把烧瓶内容物摇匀,将溶液和肉渣分装于小试管中,肉渣约用,应用无菌手续加入已灭菌的石蜡凡士林,以隔绝氧气。

(5)接种前可将上述已做好的庖肉培养基煮沸10分钟,以除去溶入的氧,如果盖有一层石蜡凡士林,需将石蜡凡士林先在火焰边微加热,使其溶化。在培养基手感不烫时按液体接种法接入巴氏芽孢梭菌,然后将接种的试管垂直,使石蜡凡士林凝固而密封培养基。再置30℃中培养。

3.  厌氧罐培养法

(1)用肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板,凝固干燥后,取两个平板,每个平板一半边划线接种巴氏芽孢梭菌,另一半边划线接种荧光假单胞菌,并标记好。取其中的一个已接种的平皿置于厌氧罐的培养皿支架上,而后放入厌氧培养罐内;另一个已接种的平皿置培养室30℃培养。

(2)剪开催化剂袋,将催化剂倒入厌氧罐盖下面的多孔催化剂盒内,拧紧催化剂盒的盒盖。

(3)剪开气体发生袋的切碎线处,并迅速将此气体发生袋置罐内金属架的夹上,再向袋中加入约10 ml 水。同时,由另一人配合,剪开指示剂袋,将指示条暴露,立即放进罐内。

(4)迅速盖好厌氧罐的盖,将固定梁旋紧,置30℃培养。

2014-12-12