质粒的制备实验

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

1.   取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37 ℃过夜培养;

2.   用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有Amp抗生素的LB培养基中,37 ℃摇床~250 r/min过夜培养;

3.   吸取1.5 ml菌液,12000 g离心2分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净;

4.  溶液m4. 加入300 μI振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块);

5.   加入300

μI 溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟;

6.   加入300
μI 溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;

7.   12000 g离心10分钟;

8.   吸取800
μI 上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;

9.   12000 g 常温离心15分钟;

10.   倒尽上清,加75%乙醇浸洗除盐(放置片刻或离心3分钟后倒去上清);

11.   室温放置或超净台上风干DNA;

12.  加40
μI 灭菌超纯水或TE溶解;

13.   质粒、BAC的质量检测,于-20 ℃保存。

2014-12-12