质粒的转化及转化子的鉴定实验-热激法

热激法:大肠杆菌在0 ℃ CaCl 2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 ℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

1.  l ml X-gal (20 mg/ml),25 ml Amp(100 mg/ml),250 ml制备选择性培养基平板:在融化的250 ml LA培养基中250 mI PTG (200 mg/ml),混匀后倒入灭菌培养皿中;

2.  取出3管制备好的感受态细胞,放在冰上融化;

3.  每100

μ l感受态细胞加入约20 ng质粒DNA,3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA(阳性对照)及不加入任何DNA(阴性对照),用移液器轻轻吸打均匀,在冰上放置30分钟;

4.  热击:将离心管放置42 ℃水浴,热击90秒,注意:勿摇动离心管;

5.  冰镇:快速将离心管转移至冰浴,放置1-2分钟;

6.  SOC培养基,在37 ℃摇床温和摇动温育45分钟,使细菌复苏;复苏:每管加400
μ l

7.  布皿:取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素(Amp)的LA平板;

8.  培养:倒置培养皿,于37 ℃培养12-16小时 即可观察到蓝白相间的菌落(其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子,蓝色菌落是载体自连的转化子)

2014-12-12