一、细菌生化反应常用培养基的制备
1. 蛋白胨水
成分:蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g、蒸馏水100 ml。
将上述成分加热溶解后校正pH7.6,分装试管,15磅15 min高压灭菌备用。常用于制备糖发酵培养基或用于检查细菌的靛基质产生试验等。
2. 糖发酵管
成分:蛋白胨水,葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麦芽糖等糖,溴甲酚紫(B.C.P)、溴麝香草酚兰(B.T.B)或酚红(P.R)等指示剂。
在蛋白胨水中加入某种糖(0.5~1%)和指示剂,分装于带一倒立小管的小试管中(图2-5),15磅20 min高压灭菌后备用。常用于糖发酵试验。
3. 葡萄糖蛋白胨水
成分:蛋白胨 0.5 g
葡萄糖 0.5 g
磷酸氢二钾 0.5 g
蒸馏水 100 ml
上述成分混合溶化后校正pH至7.0,分装试管,10磅20 min高压灭菌备用。用于V-P试验和甲基红试验。
4. 枸橼酸盐培养基
成分:枸橼酸钠 0.2g
硫酸镁 0.02g
磷酸二氢铵 0.1 g
磷酸氢二钾 0.1 g
氯化钠 0.5 g
琼脂(经流水连续彻底漂洗) 2.0 g
蒸馏水 100 ml
B.T.B酒精溶液(0.5%) 1.6 ml
加热溶化各种成分后校正pH至6.8,再加入0.5%B.T.B乙醇溶液混匀,分装试管,8磅15 min高压灭菌,趁热取出置成斜面。 用于枸橼酸盐利用试验。
5. 醋酸铅培养基
成分:普通琼脂培养基 100 ml
硫代硫酸钠 0.25 g
醋酸铅溶液(10%) 1 ml
先溶化普通琼脂培养基,然后加入硫代硫酸钠,校正pH为7.2,煮沸过滤,10磅20 min高压灭菌,取出后无菌操作加入已灭菌的10%醋酸铅溶液1 ml,混匀后装于小试管,直立凝固后备用。用于检测硫化氢的产生。
6. 尿素培养基
成分:蛋白胨 0.1 g
氯化钠 0.5 g
磷酸二氢钾 0.2 g
琼脂 2.0 g
蒸馏水 100 ml
酚红溶液(0.6%) 0.2 ml
葡萄糖溶液(10%) 0.1 ml
尿素(20%) 1 ml
在蒸馏水内加热溶化蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾和琼脂,校正pH7.4,过滤后加入0.6%酚红溶液混匀,8磅15 min高压灭菌,取出待冷至60℃,加入灭菌的10%葡萄糖溶液和20%尿素,分装于小试管内,凝成斜面备用。用于尿素分解试验。
二、细菌生化反应检查
1. 糖发酵(Fermentation of sugars)
将细菌接种于糖发酵管中,37℃培养18~24 h后观察结果。必要时可培养更长时间后再判定结果。
细菌如分解糖时,则产酸,使指示剂变色(一般记录符号是"十");有些细菌在分解糖的同时还产生气体,则倒立小管中有气泡出现(记录符号为"⊕");如细菌不分解该糖时,指示剂不变色,不见培养液混浊(记录符号为"―")。
2. IMViC 包括下述四种试验
(1) 靛基质产生(Production of indole)
将细菌接种于蛋白胨水中,37℃培养18~24 h。有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质,靛基质无色,不能直接查见,此时滴加数滴靛基质试剂(Kovacs试剂)于培养基的液面上,其接触面呈玫瑰红色者为阳性,仍呈黄色者为阴性,若颜色不明显,可再加4~5滴乙醚,振荡试管使乙醚分散于液体中,若培养液中有靛基质存在,就可以被提取至乙醚层中,颜色反应较为明显。
(注)Kofacs试剂:取对二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylaminobenzaldehyde)4g,加95%酒精380 ml,浓盐酸80 ml即成。
(2) 甲基红试验(Methyl red test)
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中,37℃培养48 h后,再向其中加入甲基红试剂3滴。大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇,培养基中酸多,pH值低,故呈红色,为阳性。而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇,培养基中酸少,pH值高,故呈黄色,为阴性。
注:甲基红试剂:取甲基红0.04 g,溶于60%的酒精100 ml中。该试剂酸性时呈红色,碱性时呈黄色。
(3) V-P试验(Voges-Proskauer test)
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中,37℃培养48h后,再向培养基中加入等量的40%氢氧化钾溶液(含有0.3%肌酸)。产气杆菌分解葡萄糖生成丙酮酸,丙酮酸又被缩合成乙酰甲基甲醇,后者遇碱被空气中氧氧化,生成二乙酰,二乙酰又和培养基中的胍基化合物发生反应,生成红色化合物,培养基变红色,是为V-P试验阳性,其他细菌不能生成乙酰甲基甲醇,培养基不变色,为阴性。
(4) 枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate)
将细菌接种于枸橼酸盐培养基上,37℃培养48 h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源,分解枸橼酸盐生成碳酸盐,使培养基变为碱性,培养基中的指示剂由淡绿色转为深蓝色,为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐,培养基颜色不变,为阴性。
3. 硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中,37℃培养24 h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸,生成硫化氢,穿刺部位呈黑褐色,是为反应阳性。培养基颜色无变化,则为阴性。
4. 尿素分解试验(Splitting of urea)
将细菌接种于尿素培养基中,37℃培养18~24 h。变形杆菌能迅速(2~4 h)分解尿素产生大量的氨,使培养基变碱而呈紫红色,是为阳性反应。
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