1. 实验前两天,将转化用酵母菌株的单菌落接种于5 ml YPD培养基中,30℃过夜培养至饱和。
2. 转化前一天晚上,在装有500 ml YPD培养基的2 L 无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液,于30℃剧烈摇动培养过夜,直到细胞密度达1×10 8 细胞/ml(OD600≈1.3~1.5,依据菌株不同而异)。
3. 于4℃以4 000 g 离心收获培养细胞,细胞用80 ml 无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性,继续步骤4。如果这种处理并不需要的话,可接步骤6。
4. 加入10 ml 10×TE缓冲液,pH7.5。搖晃混匀,再加入10 ml 10×乙酸锂贮液,旋转摇匀,于30℃轻轻摇动45 min。
5. 加2.5 ml 1 mol/l DTT并同时旋转摇动,于30℃轻轻摇动15 min。
5. 加2.5 ml 1 mol/l DTT并同时旋转摇动,于30℃轻轻摇动15 min。
6. 将酵母菌悬液稀释在500 ml 水中、洗涤3次,每次以4 000~6 000 g 于4℃离心沉淀细胞,依次重悬细胞,所用的溶液如下:
(1)第一次沉淀:250 ml 冰冷的水
(2)第二次沉淀:20~30 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇
(3)第三次沉淀:0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇
(1)第一次沉淀:250 ml 冰冷的水
(2)第二次沉淀:20~30 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇
(3)第三次沉淀:0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇
使用Bio-Rad公司的Gene Pusler:
9a. 往一个无菌、冰冷的1.5 ml 微量离心管加入40 μl 浓缩的酵母菌细胞和≤100 ng 待转化的DNA(体枳≤5 μl),混匀。
10a. 将酵母与转化DNA混合物转移到冰冷的0.2 cm 间隙的一次性电击池中。
11a. 以1.5 KV、25 μF、200 Ω 作脉冲转化,电路中应包括Bio-Rad脉冲控制仪,而这十分重要,如果不这样的话,将会损坏Gene Pulser。
11a. 以1.5 KV、25 μF、200 Ω 作脉冲转化,电路中应包括Bio-Rad脉冲控制仪,而这十分重要,如果不这样的话,将会损坏Gene Pulser。
12a. 往电击池加入1 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇回收酵母细胞,然后用无菌的巴斯德吸管轻轻吹吸混匀。
13a. 将酵母菌液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上,于30℃培养3~6天,直到平板上出现菌落。
使用Life Technologies 的 Cell-Porator:
9b. 往一支无菌,冰冷的1.5 ml 微量离心管中,加入20 μl 浓缩的酵母菌和待转化的DNA。DNA用量要≤100 ng,体积≤5 μl。
9b. 往一支无菌,冰冷的1.5 ml 微量离心管中,加入20 μl 浓缩的酵母菌和待转化的DNA。DNA用量要≤100 ng,体积≤5 μl。
10b. 将酵母菌/DNA混合物转移到0.15 cm 间隙的电转槽中。
11b. 以400 V,10 μF,低电阻下进行脉冲转化。
11b. 以400 V,10 μF,低电阻下进行脉冲转化。
12b. 取10 μl 电转混合物加到1.5 ml 无菌的微离心管中,其中含有0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇。
13b. 将酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上,于30℃培养3~6天,直到平板上出现菌落。