克隆化酵母DNA的操作实验-基本方案(穿梭质粒)

1.  构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株,及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。

2.  将必需基因亚克隆到YCp载体(带有URA3以外的选择标志),取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。

3.  转化至步骤1的菌株中,在添加了尿嘧啶的省却成分平极上,选择YCp质粒,于允许温度下培养(通常为25℃)。

4.  将每一个转化平板影印到两个带有5-FOA并能选择YCp载体的平板上,其中一个平板于允许温度下培养,另一个于非允许温度下培养(通常为36℃)。


5.  选取在允许温度而不是非允许温度下出现乳头状菌落,从转化平板上回收这些 菌落,并划线分离单茵落。
6.  在两种温度下从每一个待检测Ura - 乳头状菌落中重复检测大约6个单菌落,作为对照,在两种温度下用平板培养,以排除无关染色体的温度敏感突变,对于每一个经过重复检验的温度敏感突变,从培养于允许温度下的5-FOA平板上回收Ura - 乳头状菌落(在另一个对YCp载体保持选择压力的平板上划线分离),通过转化大肠杆菌从这些菌株中回收质粒(现在只含有YCp载体)。

7.  将基因(现在带有ts突变)亚克隆到YIp5的载体并应用移换技术将此突变基因引入染色体位点。

2014-12-12