酵母菌RNA制备实验-基本方案(热酸性酚抽提法)

1.  酵母细胞在10 ml 培养基中生长至指数中期(OD 600 =1.0)。
2.  将培养液转移到50 ml,离心管,于4℃,1 500 g 离心3 min。
3.  弃上清,菌体沉淀用1 ml 冰冷的水重悬,转移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中, 4℃离心10 s,弃上清,继续步骤4。需要时,将离心管置于干冰上速冻。
4.  用400 μl TSE溶液重悬细胞沉淀,加400 μl 酸性酚,激烈振荡10 s,65℃温育30~60 min,不时用旋涡振荡器短暂振荡。
5.  冰浴放置5 min,4℃高速离心5 min。
6.  水(上)相移到一个干净的1.5 ml 微量离心管中,加400 μl 酸性酚,激烈振荡,重复步骤5。
7.  将水相移到一个干净的1.5 ml 微量离心管中,加入400 μl 氯仿,激烈振荡,4℃高速离心5 min。
8.  将水相移到一个新管中,加40 μl 3mol/l 乙酸钠,pH5.3及1 ml 冰冷的无水乙醇沉淀,4℃高速离心5 min,在冰冷的70%乙醇中快速振荡以洗涤RNA沉淀。如上离心以沉淀RNA。
9.  沉淀用50 μl 水重溶,用分光光度法测A 260 及A 280 以确定浓度,于-70℃或-20℃贮存,可使用1年。
注意事项
不要用高浓度的细胞制备RNA,因为进入静止期后,结果的一致性差,RNA产量不稳定。

2014-12-12