质粒DNA的小量制备实验-煮沸小量制备法

当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。推荐采用本方案从1-24个菌落培养液中制备少量的质粒DNA,尽管该方案十分快捷,但制备的DNA的质量要比碱裂解法差。 1.  参考文献:Birnboim,1983; Heetal., 1991; Holmes and Quigley, 1981.

2.  撰稿人:JoAnneEngebrecht, Roger Brent, and Mustak A, Kaderbhai

1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养基中,于37°C培养至饱和状态或至少到对数生长中期(约6 h)。

2.  取1.5 ml菌液以最大转速离心20 s,弃上清。

3.  加入300 μl含200 μg溶菌酶的STET溶液重悬沉淀。在涡旋混合器上振荡混匀,冰上放置 30 s~10 min。

4.  将管放人沸水中(100°C)1-2 min。

5.  离心15-30 min,吸上清移入一个新的微量离心管中。

6.  加人200 μl预冷的异丙醇,于-20°C放置15-30 min。

7.  以最大转速离心 5min,倒转离心管,弹数次,去除上清,真空干燥直至沉淀呈透明。

8.  沉淀溶于50 μl TE缓冲液中,于4°C短期保存,于-20°C或-70°C长期保存。取5 μl进行限制酶酶切分析。

注意事项
1.  为了获得高产量的DNA,一定要使菌体完全重悬。

2.  如有必要,往待消化混合液中加人10 mg/ml RNA酶溶液(不含DNA酶,见3. 10)以去除 污染的RNA。

2014-12-12