高压蒸气灭菌是在高压灭菌器内进行。高压灭菌器有坚固的双层金属壁蒸锅和严密的盖，并附有排气及安全阀门，压力表等装置。加水于底部夹层锅内，加热煮沸，使产生的蒸气密闭在容器内，不能向外扩散。因而蒸气压力逐渐升高，温度也随之相应地增高。
1. 加水至锅内达规定的水平面，放入待灭菌的物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个）依次扭紧，使锅盖确实均匀密闭。
2. 锅下用煤气炉，电炉或火炉加热，若系蒸气加热装置者，则可直接将蒸气通入灭菌器内。
3. 注视压力表，当压力升到5 磅时，打开排气阀门，使锅内冷空气完全排出，待有大量蒸气溢出（呈白色雾状气流，并发出哨音）时，即可认为锅内冷空气已被排尽。
4. 关闭排气阀门，继续加热，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（例如15 磅），即调节热源，维持20～30 分钟，可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。
5. 间到达后，停止加热，待压力自行下降，或缓缓打开排气阀门放气，当压力表指针恢复至"0"时，方可打开锅盖，取出灭菌物品。
注意事项
1. 使用时应注意检查排气活塞及安全阀门，特别是压力表的性能是否正常，以免发生危险。
2. 灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，影响灭菌效果。
3. 灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力并非全都是蒸气压力，灭菌将不彻底。
4. 灭菌过程中及灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免瓶内液体冲出外溢。
2. 灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，影响灭菌效果。
3. 灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力并非全都是蒸气压力，灭菌将不彻底。
4. 灭菌过程中及灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免瓶内液体冲出外溢。