昆虫细胞的保存和培养实验

1.  将4 ml 含10%胎牛血清的完全昆虫细胞培养基加入一个25 cm 2 培养瓶。取出一支冻存Sf9细胞的安瓿,迅速置于37℃水浴,用手前后剧烈摇动融化之,当安瓿的内容物几乎完全融化时,将安瓿浸入70%乙醇,消毒外壁。

2.  打碎安瓿颈部,将内容物转移至25 cm 2 培养瓶,用手轻轻摇动培养瓶,使细胞分散均匀,于27℃温育2~3 h 直到细胞贴壁。

3.  除去旧培养液,换5 ml 含10%胎牛血清的新鲜完全培养液。继续温育,每3天换液一次,直到细胞生长汇片。

4.  准备一个新的25 cm 2 培养瓶,加入4 ml 含10%胎牛血清的完全培养液

5.  当Sf9细胞已生长汇片时,弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的完全培养液,用移液管轻柔吹打或用手掌轻拍培养瓶,重悬细胞。

6.  用为培养组织细胞所设计的血细胞计数器计数细胞,在25 cm 2 培养瓶中接种1×10 6 ~2×10 6 个细胞,摇动培养瓶使细胞均匀分布。于27℃温育,每3天用含10%FBS的完全培养基换液,直到培养瓶中的细胞生长汇片。
7.  弃去汇片的单层培养细胞中的培养液,并重悬细胞。
8.  用血细胞计数器计数细胞。以约4×10 5 ~5×10 5 细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中。于27℃温育,以60~80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔,以保证充足的空气。
9.  每隔2~3天进行细胞计数,当细胞密度达到2×10 6 ~2×10 6 细胞/ml 时进行传代, 将适量细胞移至一个含有新鲜完全培养液的新培养瓶中,使终密度达到4×10 5 ~5×10 5 细胞/ml。或者,倒出适当体枳的细胞悬液,代之以新鲜培养液。
10.  加入0.1 ml 的0.4%台盼蓝于1 ml 对数生长的细胞中,确定细胞活力。在低倍显微镜下检査细胞,计数被台盼蓝染色的细胞(死细胞),并计算总细胞数。
11.  将细胞传代至1份完全培养液/10%胎牛血请清和1份无血清培养液混合的液体中。让细胞长至汇片(单层培养),或达到2×10 6 ~3×10 6 细胞/ml 的密度(悬浮培养)。
12.  将细胞传代至含胎牛血清完全培养液与无血清培养液比例为1:4的混合液中,让细胞生长。
13.  用完全培养液与无血清培养液比例为1:8至1:10的混合液,重复细胞传代与细胞生长的步骤。
14.  用无血清培养液传代细胞。
15.  计数呈指数生长的待冻存细胞,于室温以1 000g 离心10 min,弃去上清液。
16.  用含10%胎牛血清的完全培养液以1×10 7 ~2×10 7 细胞/ml 的密度重悬细胞团块。 加入等体积含10%胎牛血清和20%DMSO的完全培养液,将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞移入带螺口盖的冻存管中,于-20℃保存2 h,然后于-70℃过夜。
17.  将冻结的细胞移至液氮罐中以便长期保存。

2014-12-12