质粒DNA的小量制备实验-96孔微量滴定板碱裂解法

这个方案可以在一天内快速制备数以百计的质粒。
1.  在96孔微量滴定板上每孔中加人0.3 ml TYGPN培养液,每孔中接种一个含有质粒的单菌落,于37°C培养至饱和状态(约48h)。

2.  饱和培养液于4°C,以600 g用带有微孔板卡槽的H-1000B转子离心10 min,轻轻甩去每孔中的上清液。


3.  将平板夹在多管涡旋混合器上置4挡振荡20 s,重悬细菌。

4.  每孔先加人50 μl GTE溶液,再加人100 μl NaOH/SDS溶液,放置2 min。

5.  每孔加人50 μl 乙酸钟溶液,盖上盖子或封口膜(Parafilm)。

6.  于涡旋混合器上置4挡剧烈振荡20 s,然后于4°C,600 g离心5 min。

7.  用枪头插人孔底的U字型的壁底,从每孔吸取200 μl 上清液至另一块新的平板中。

8.  在新板每孔中加入150 μl 异丙醇,盖好盖子,振动混匀,于-20°C冷冻30 min。

9.  于4°C,600 g离心25 min,弃上清。用冰冷的70%乙醇洗涤沉淀,轻轻吸去上清,再用95%乙醇洗涤,同样轻轻吸去上清。

10  空气中干燥30 min后用50 μl TE重溶沉淀。于4°C短期保存,于-20°C或-70°C长期保存。并每孔取10 μl 进行分析。

2014-12-12