激光扫描共聚焦显微镜使用说明

激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。 由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
一、观察及仪器操作

1.  开启仪器电源及光源

一般先开启显微镜和激光器,再启动计算机,然后启动操作软件,设置荧光样品的激发光波长,选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube,PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。

2.  设置相应的扫描方式
在目视模式下.调整所用物镜放大倍数,在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式,调整双孔针和激光强度参数,即可得到清晰的共聚焦图像。
3.  获取图像
选择合适的图像分辨率,将样品完整扫描后,保存图像结果即可。
4.  关闭仪器
仪器测定样品结束后,先关闭激光器部分,计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统.则应该在激光器关闭后,待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
二、获取三维图像

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能,因此,它可以在不损伤细胞的情况下,获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式,即可实现此项功能。
1.  开启“Z-Stack”选项。
2.  确定光学切片的位置及层数。
3.  启动“Start”,获得三维图像。
三、获取时间序列图像

共聚焦显微镜的"Time-Series"功能,可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量,开启“Start T”功能键,即可进行实验。“Time-Series"功能大大减轻了实验者的劳动强度,对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。
注意事项
1.  仪器周围要远离电磁辐射源;
2.  环境无震动,无强烈的空气扰动;
3.  室内具有遮光系统,保证荧光样品不会被外源光漂白;
4.  环境清洁;
5.  控制工作温度在5~25℃。

2014-12-12