昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立实验

采用两种不同的肿瘤细胞株分别在昆明小鼠胃部原位建立胃癌模型。造模后对原位移植瘤的生长速度进行观察,并对胃癌组织中v EG F 的表达及M v D进行检测,结果显示模型的成瘤率均为10 0%。昆明鼠胃部原位移植瘤的生长速度快,缩短了胃癌模型建立周期, 为筛选抗胃癌药物提供了有效简单的模型。

一、昆明小鼠皮下移植瘤传代

S180 细胞注人小鼠腹腔内, 进行体外培养,5 -7 d 可见小鼠腹部肿胀,有腹水,收集腹水, 细胞计数,调整细胞密度在2 x 10 6 - 2x 10 7 注射到昆明小鼠的腋部皮下形成实体瘤。待肿瘤生长至直径1.5 -2.0 cm 之间,处死小鼠,按上述方法反复传3 代后作为原位移植用瘤源。

二、 原位移植模型的建立

1.  取一中传3 代后生长4 周左右处于对数生长期的昆明小鼠, 常规消毒,从腋部皮下剥取肿瘤组织。

2.  剔除纤维包膜、血管,切开去除中间坏死的组织,选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织,剪成约1-2 mm ,小块备用。

3.  昆明小鼠术前禁食12 h, 以0.5% 戊巴比妥钠腹腔内注射(50 mg/kg)麻醉, 固定小鼠,常规消毒皮肤,用手术剪刀在小鼠沿左侧腹部正中旁线切开,切口约1.5 cm ,小心暴露腹膜、胃壁,用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆膜层, 以出血为度,用无齿镊将破损处向内推压,使局部胃壁形成凹完,植入1 块1-2 mm 3 瘤组织块,并在瘤表面滴1 滴OB生物胶, 使其覆盖瘤组织表面, 然后分层关腹。

4.  人胃癌组织块昆明小鼠原位种植后, 逐日观察裸鼠全身状况,运动情况,腹部体征。若实验过程中出现动物死亡,记录时间, 并全面探查腹腔,观察胃肿瘤原位生长情况。

三、 处死动物及移植瘤的观察
定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征、移植后脱颈处死解剖,取原位瘤。所取标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色,做组织病理学检查。
四、免疫组化染色
1.  采用EnVision免疫组织化学技术检测VEGF蛋白表达。EnVision是一种两步法免疫组化新技术,具有简便、特
异和敏感等特点。

2.  操作步骤如下,选取薄(3-4 μm)而平整的组织切片,浸二甲苯脱蜡, 梯度酒精水化后微波修复抗原,室温冷却后PBS 洗涤5 min。

3.  切片放人H 2 O 2 液中封闭10 min,PBS 洗涤5 min,滴加1:100稀释的抗VEGF抗体置于37 ℃ 恒温孵育60 min,PBS 洗涤5 min。

4.  滴加二抗置于37℃恒温孵育30 min,PBS 洗涤5 min。

5.  DAB显色液显色,室温下染色时间约8-20 min,在显微镜下根据颜色的发展掌握染色时间。

6.  显色结束后放人PBS 洗涤5 min,苏木素复染,封片。

7.  以PBS 代替一抗为阴性对照。

8.  VEGF阳性结果判断:随机取5 个高倍视野,以其阳性细胞百分比计,≤5 % 为阴性(+) ,6%-25 % 为弱阳性( + ) ,26%-50%为中等强度阳性( + + ),≥51 % 为强阳性( ++ + ) 。
五、 移植瘤微血管密度的测定
1.  采用EnVision 法,方法同4 ,一抗为兔抗鼠CD31 抗体,稀释倍数为1:10 0 。

2.  用PBS 代替一抗作为阴性对照。

3.  移植瘤MvD 按照Weidner等的评判标准, 计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管, 凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为1 个血管计数,但肌层较厚及管腔面积大于8 个红细胞直径的血管不计数。

4.  首先在100x 镜下寻找血管数目最高的区域, 然后在200x 镜下计数5个区域中的微血管数目,取均值代表。
六、 统计学处理
移植瘤MVD资料用无士SD 表示,采用t 检验。

2014-12-12