双脱氧法DNA测序实验-α-标记核苷酸进行热循环测序反应

1.  对应于毎个待测模板,分别以A、G、C、T 标记好4个微量离心管。

2.  分别往标好A、G、C、T 的管子中,加A、G、C、T 测序混合液各3 μl。

3.  对于单链模板:在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

(1)0.04 pmol 单链DNA模板

(2)0.6 pmol 引物

(3)1.5 μl 10×Vent R (exo - )测序缓冲液

(4)1 μl 3%Triton X-100

(5)加水至12 μl

(6)用吸管上下抽吸轻轻混匀溶液。

4.  对于双链DNA模板: 在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

(1)0.1 pmol 双链DNA模板

(2)1.2 pmol 引物

(3)1.5 μl 10×Vent R (exo - )测序缓冲液

(4)1 μl 3%Triton X-100

(5)加水至12 μl

(6)通过用吸管上下抽吸,使溶液混匀。

5.  毎个模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml[α- 35 S]dNATP、[α- 32 P]dNATP或[α- 32 P]dNATP,用吸管轻轻上下抽吸混合溶液。

6.  经步骤5操作后的管子,加入1 μl 2 000 U/ml 的Vent R (exo - )DNA聚合酶。
7.  立即往步骤2的含Vent R (exo - )测序混合物A的管子中加入3.2 μl 步骤5操作后所得的混合物。

8.  分别重复此过程于C、G、T管,每次均换吸头,反应混合物,置于冰上。

9.  往每个反应混合物上滴入1滴无菌矿物油。

10.  在热循环反应装置中设定如下反应条件:20循环:20 s,90℃;20 s,55℃;20 s,72℃反应管放入热循环仪中,启动程序。

11.  在矿物油层下加入4 μl TCS终止/加样染料。
12.  样品在85℃温育3 min。

13.  将吸管头插入覆盖矿物油层下面的反应物中,取2 μl 加样于测序胶进行电泳,并读出序列。

2014-12-12