肝脏药物代谢酶CYP450含量测定实验

药物的体内代谢过程可分为I相反应(分解代谢)及II相反应(合成代谢)。I相反应包括氧化、还原和水解反应,主要由细胞色素P450(CYP450)酶催化。CYP450酶主要分布在肝脏,故又称作肝药酶。CYP450酶的诱导和抑制具有重要的临床意义,可导致临床上的药物相互作用。苯巴比妥钠为CYP450酶的诱导剂,而放线菌素D为CYP450酶的抑制剂。本实验通过测定苯巴比妥钠和放线菌素D对肝脏CYP450酶含量的影响,介绍了肝药酶诱导剂及抑制剂的筛选方法之一。 CYP450酶含量的测定:CYP450为血红素蛋白,其还原型与CO结合后,在波长450nm处出现吸收峰,故可通过测定溶液的吸光度值,反映溶液中CYP450酶的含量。

1. 分组 先将小鼠逐一称重,按照体重由小到大(或由大到小)排序。根据简化随机原则将小鼠分为3组(甲、乙、丙),每组3只。

2. 腹腔注射给药 甲组为0.75%苯巴比妥钠溶液,乙组为0.002%放线菌素D溶液,丙组为生理盐水。每组小鼠均连续给药3天。

3.制备肝匀浆 小鼠处死,取出肝脏,注意勿破坏胆囊。称重后,将肝组织置于玻璃匀浆器中,加入预冷后的0.25mol/L蔗糖液(0.5ml/100mg肝组织),冰浴下研磨至淡粉色匀浆。然后4摄氏度下10,000g离心20 min后,留取上清液。

4. CYP450酶含量的测定 取离心后上清液1ml,加入预冷后的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液9ml,充分混匀。冰浴下通CO气,1~2气泡/s,通气2min。将通气完毕的溶液分为两半,分别置于两个试管中:其一作为测定吸光度时的参照杯,另一加入连二亚硫酸钠5mg,充分混匀,即为待测样品杯。测定并记录样品杯在450nm和490nm波长下的吸光度值(表23-4)。

5. 计算CYP450酶含量

根据公式A = E·C·L,其中

A:吸光度

E:490nm到450nm波长的示差光谱消光系数,本实验中E = 104L/cm·mmol

C:CYP450浓度

L:比色杯厚度(光路长度),本实验中比色杯为1cm

因此,得到CYP450(nmol/g肝脏)= [(A450 - A490) / E·L]×50000

6. CYP450酶的诱导和抑制

(1) CYP P450升高百分率:

[(苯巴比妥组-生理盐水对照组) /生理盐水对照组]×100%

(2) CYP P450降低百分率:

[(生理盐水对照组-放线菌素D组) /生理盐水对照组]×100%

注意事项
1. 本实验制备肝匀浆过程均需于冰上操作完成,所使用的溶液均需预先置于冰中预冷,以避免操作过程中造成的CYP450酶损失和破坏。

2. 取出肝脏过程中,注意不要破坏胆囊,以避免胆红素对CYP450血红素蛋白测定的影响和干扰。

3. CYP450(nmol/g肝脏)= [(A450 - A490) / E·L]×50000的计算公式,其中50000为本实验制备肝匀浆过程中的稀释倍数。

4.测定肝匀浆中CYP450酶含量为简单、粗略的测定方法。肝脏CYP450酶主要存在于肝细胞的滑面内质网上,故可采用超速离心法提取肝微粒体后,测定肝微粒体的CYP450含量。提取肝微粒体后亦可进一步与CYP450酶底物探药共孵育,从而测定CYP450酶对底物药物的代谢活性。提取肝微粒体方法简述如下:将肝匀浆离心后得到的上清液,4°C下105,000 g离心60 min,留取离心后的沉淀,加入肝微粒体重悬液(0.25 M蔗糖-0.1 M磷酸钾缓冲液,1 mM EDTA,pH 7.4,1 ml/g肝脏)重悬,-80°C储存待用。

5. 本实验中CYP450酶含量的单位为nmol/g肝脏。若提取肝微粒体后,可通过测定肝微粒体的蛋白浓度(如Bradford法),求得单位蛋白浓度的CYP450酶含量。

2014-12-12