质粒DNA导入细菌细胞实验-电转化法

高压电转化简单,快捷可靠,而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。

1. 参考文献: Doweretal.,1988; Hanahan,1983。

2. 撰稿人: ChristineE. Seidman,Kevin Struhl,and Jen Sheen

1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37°C温和振摇培养5 h或过夜。

2.  将2.5 ml培养物加入到盛有500 ml LB培养液的2 L烧瓶中,37°C,振摇(300 r/min)培养至OD 600 为0.5~0.6。

3.  细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1 L离心瓶中。

4.  于2°C,5000 g离心20 min,弃上清,沉淀用5 ml预冷的水溶解。

5.  加入500 ml冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次。

6.  立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。重复步骤5。

7.  立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。

8.  (1)对于立即使用

将悬浮液加入到预冷的50 ml聚丙烯管中,2°C 5000 g离心10 min。置冰上,估计细胞沉淀的体积(约500
μl /500 ml培养液),沉淀用等体积的冰冷水重悬,并按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

新鲜制备的细菌其转化效率要高于冻存的细菌。细胞密度大约2X10 11
细胞/ml。

(2)冻存细菌

加入40 ml冰冷的10% (V/V)甘油,混合,然后按照步骤(1)离心, 估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。按50~300
μl 分装于预冷的微量离心管中。于干冰上冷冻并储存于-80 °C。

9.  为检测感受态的效果,按照以下各步骤将PBR322转化到感受态细菌。将合适体积的转化物(1、10和25 μl )涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37°C培养过夜。

计算转化率

每微克DNA=每滴液体体积(
μl) 含有的克隆数X10 5

新鲜生长的细胞,一般都有>10 9 克隆数/ μ gDNA。

有2.5X10
10 ~ 14X10 10 转化子/ μg

10.  将电转化仪调到2.5 kV、25 μ F,脉冲控制器调到200~400 Ω

11.  将1 μl 质粒DNA (5 pg~0.5 ng)加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。

增大DNA体积和高浓度的盐离子(应小于1 mmol/L)会降低转化效率。

12.  将转化混合物转移到已放置冰上5 min预冷的电转化池中,用Kimwpie吸水纸吸干 电转池的外表面,然后放人电转仪中,按操作进行脉冲电转化。

13.  取出电转化池,马上把细胞转移至一个含1 ml预热的SOC培养液的无菌培养管 中。于37°C,中速振荡培养30~60 min。

14.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上,选择和保存转化子。
注意事项
1.  所有与细菌接触的材料都应该是无菌的。

2014-12-12