（5）加热至70℃，然后在30 min 以上的时间內，慢慢冷却至30 ℃

2.  当模板混合物冷却的同时，各取2 μl 小份的A、C、T、G引物终止混合液，加于4个独立的微量离心管或微量滴定板的孔中，然后做好A、C、G、T的标志。

3.  在65℃预热盛有终止混合物的管子或滴定板。

4.  加入1 μl Bst DNA聚合酶于步骤1冷却后的模板混合物中。

5.  步骤2准备好的每个引物终止混合物中，各加入2.5 μl 聚合酶/模板混合液，于65℃温育5 min。

6.  用水将20×追加溶液贮液稀释成1×追加溶液，往每个样品管或孔中各加入2 μl 1×追加溶液，于65℃温育5 min。

7.  各管或孔中加入4 μl终止溶液。

8.  准备好标准的0.2~0.4 mm 厚含8 mol/l 尿素的测序胶。

9.  加样前，样品于80℃温育2 min，置于冰浴，加样2~3 μl，电泳，监测示踪染料的迁移。

10.  剪三张与凝胶大小刚好或稍大的Whatman 3MM 滤纸，剪下一片能盖过凝胶需转移 区域的尼龙膜。

11.  拆卸凝胶装置，分开玻璃平板。

12.  将一张Whatman 3MM 干滤纸放于凝胶上，然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。

13.  将贴着凝胶的滤纸，胶面朝上放在玻璃平板上。

14.  将尼龙膜浸没TBE缓冲液中，或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。

15.  小心将湿润的膜放在凝胶上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。

16.  在膜的上面放两张Whatman 3MM 干滤纸，滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，转移1 h。

17.  分离测序胶/膜夹层，小心从凝胶上剥下膜，并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志，将膜放在滤纸上，晾干约10 min。

18.  使用紫外线交联装置，紫外透照仪或手恃式紫外灯，照射转印膜以固定DNA，总紫外线照量为120 MJ/cm ² 。

19.  接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间，在 4 ℃可保存6个月。

20.  将膜放入可加热封闭的大袋子中，加入500 ml 封阻液Ⅰ，小心排去气泡，密封口袋，放置10 min。

21.  按下述过裎处理膜

（1）200 ml  偶联物缓冲液20 min

（2）500 ml  封阻液15 min

（3）500 ml  洗涤缓冲液Ⅰ10 min，3次

（4）500 ml  分析缓冲液2 min

（5）50 ml 二氧杂环丁烷检测5 min