在本实验方案，测序胶底部的缓冲液浓度大于其顶部浓度，使得短寡核苷酸片段（胶底部）的迁移率相对比长寡核苷酸（顶部）的迁移率要慢一些，这洋凝胶可电泳更长的时间而不至于短核苷醆从底部走失并改善了长核苷酸链的分离度。

1.  按基本方案步骤1~5组装凝胶平板夹层。

2.  在2个100 ml 烧杯中，配制缓冲液梯度凝胶溶液：50 ml 用0.5×TBE配制，25 ml 用2.5×TBE配制，在50℃以下加热至固体完全溶解，冷却至室 温，加人20 μl TEMED和200 μl 10%SDS过硫酸氨于0.5 ×TBE / 凝胶溶液，轻轻混匀。加入10 μl TEMED及100 μl 10%过硫酸铵于2.5×TBE / 凝胶溶液中轻轻混匀。

3.  用23 ml 带橡皮吸球的吸管，吸出12.5 ml 清亮的0.5×TBE / 凝胶溶液，接着吸出12.5 ml 2.5×TBE / 凝胶溶液，可通过轻轻挤压橡皮吸球以引进3~4个气泡。

4.  缓缓平稳地将溶液注入胶模的夹层，接着用同一吸管，加入剩余的0.5×TBE凝胶溶液。如基本方案步骤8~10，插入梳子，安装夹子，观察凝胶的聚合。

5.  按基本方案步骤11~33电泳及处理凝胶。